[发明专利]一种用于棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法

权利要求书

1.一种用于棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法，其特征在于，使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套核心引物对待测品种进行检测，所述核心引物的核苷酸序列如下所示：

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2.根据权利要求1所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，包括提取待测品种的DNA、使用权利要求1所述26对核心引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。

3.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种粉碎后，加入SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴；加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀，离心；取上清，加入浓度为10mg/mlRNase，水浴；抽提后离心取上清，加入异丙醇，待DNA成团析出后，用乙醇洗涤DNA沉淀，加入TE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

4.根据权利要求2或3所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤：将去壳棉种充分粉碎后，加入800μl SDS提取液，漩涡充分后，65℃水浴30min，间隔10min轻摇一次；加入等体积800μl体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，混匀至不分层，10000rpm离心10min；取上清，加入浓度为10mg/ml的1μlRNase，37℃水浴30min；重复抽提一次后离心取上清，加入0.7倍体积异丙醇，待DNA成团析出后，70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，加入 200μlTE或ddH₂O充分溶解DNA，备用。

5.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述SSR-PCR扩增反应体系，其中20μl反应液中包括：1.5mmol/L MgCl₂，0.1mmol/L dNTP，1×Buffer，0.3μmol/L SSR引物，1U Taq DNA聚合酶，2μl DNA模板；反应程序为：95℃预变性2min，一个循环；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸7min，一个循环；4℃保存待用。

6.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述电泳步骤中，PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒功率80W电泳1h。

7.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法，其特征在于，所述银染检测包括以下步骤：用10％乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液固定10min；用双蒸水快速漂洗1次；用0.2％AgNO₃溶液染色5min；用双蒸水快速漂洗1次；用3％NaOH和0.5％甲醛组成的显影液显影；用10％无水乙醇和0.5％冰醋酸组成的固定液定影。