[发明专利]HPV58 L1基因及载体、菌株和表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达的58型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因，以及含有该基因的载体、菌株及表达该基因的方法。 

背景技术

宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤，全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌，27万妇女死于此病，年龄标准化感染率达10.5％。早在80年代初，Harald zur Hausen就发现人乳头瘤病毒(humanpapilloma virus，HPV)的感染与宫颈癌发病有关，后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止，已发现了百余种HPV基因型，其中约40种可以感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型别为HPV16、18、31、33、45、52和58，90％以上的宫颈癌与它们有关。 

HPV不同型别在各地流行趋势不同，全球范围内主要以HPV16和HPV18为主，分别占约60％和14％。而在亚洲和非洲，有不少研究表明HPV58、52和33等型别的感染在宫颈癌或其前期病变中的流行程度超过了HPV18。 

在中国，在侵染性宫颈癌(invasive cervical cancer，ICC)中HPV感染型别以HPV 16和HPV18为主，分别占约60％和10％；而在原位宫颈癌(carcinoma in situ)与宫颈癌前病变——宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)II、III级的HPV感染型别以HPV 16和HPV58为主，分别占约25％和13.1％；CIN I级的HPV感染型别同样以HPV16，58为主，分别占约21.6％和15.7％。因此，HPV58在中国的流行程度相当高，开发预防性HPV疫苗时，针对危险性仅次于HPV 16的HPV 58具有重要意义。 

HPV是无包膜二十面体对称病毒，其病毒基因组DNA为闭合环状，长度约7200-8000bp，由早期编码区(early region)、晚期编码区(lateregion)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF)，编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋 白分子量约55kDa，为主要衣壳蛋白，以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构，在不同型别中氨基酸序列高度保守，能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小，多位于L1蛋白内部。 

昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似，可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。 

因此，鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守，并且能够单独表达形成VLP，以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过，以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题，其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中，往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为36μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。 

因此，本领域中需要一种高水平表达HPV58 L1基因的方法，所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV58 L1基因。 

发明内容

为了解决上述技术问题，根据本发明的第一方面，提供了一种能够在毕赤酵母中高效表达的HPV58 L1基因，所述基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 

利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统，具有表达量高、操作简便、成本低等特点，并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一，在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候，往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此，本发明的经过密码子优化后的HPV58 L1基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平，更有利于针对HPV58的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示，本发明的密码子优化过的HPV58 L1基因在毕赤酵母中的表达量可最高达约120μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)。