[发明专利]虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法及虾白斑综合症病毒检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术中的病毒检测领域，具体涉及一种虾白斑综合症病毒病核酸样品制备方法以及利用核酸样品经LAMP扩增后检测虾白斑综合症病毒的方法。

背景技术

白斑综合征病毒病是一种烈性病毒性传染病，其病原为白斑综合征病毒(WSSV)，WSSV是一种感染力极强、致死率极高的病毒，可在感染一周内死亡率高达80％-100％，而且其宿主域非常广泛，已经成为海、淡水养殖对虾或者螯虾中具有严重威胁的疾病，一旦发病就难以做到及时治疗，可能导致养殖虾类出现暴发性死亡，严重的甚至会导致整池绝产，给广大养殖者造成惨重损失。目前WSSV已遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲。在已报道的所有对虾病毒中，该病毒毒力最强，危害最大，南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、白对虾、褐对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、斑节对虾等，大部分养殖对虾皆可被WSSV侵染，在浮游生物、海葵、糠虾、白虾、毛虾、天津厚蟹、日本大眼蟹等动物中可检测出WSSV，在虾池的蟹、桡足类和昆虫(Ephydridae)体内也检到过WSSV，因此早在1995年国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)就将其列为需要报告的重要的水生动物病毒病病原之一。国内外普遍认为只有综合预防才能控制WSSV。用碘制剂消毒养殖池水、给养殖虾投喂免疫增强剂、监控养殖塘的各项水质指标以及采取及时清理死虾、病虾以切断病毒传播途径。总的来说，采用减少感染机会的措施是大多数养殖户用以避免健康虾感染WSSV的主要方法。

有关WSSV的研究在病原学、病理学、流行病学以及诊断学研究方面已深入到分子水平，但由于由于诸多原因，到目前为止还不能完全控制WSSV的疫情，面对WSSV的传播所能采取最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果断切断传播途径，特别是在养殖环境中，早期灵敏、简便、快速的诊断可以为及时采取有效措施，减少损失，防WSSV大规模暴发提供科学的依据。

近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP，loop-mediated isothermalamplification)，是一种全新的恒温核酸扩增方法，该方法可以高灵敏地非常有选择性地高效扩增靶序列(Notomi et al.，2000)，最终的LAMP产物是是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱。它具有所需仪器少：只需要一个恒温装置就可以；灵敏高：模板仅需要10个拷贝或更少；扩增特异性强：应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；检测时间短：一般扩增可以在60min以内完成，比普通PCR反应还要省时间。因此LAMP在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。通常为了使用LAMP方法实现检测，需要先期制备供扩增用的模板，在LAMP扩增后，还需要对扩增产物进行可视化观察，以确定LAMP的最终扩增结果，该结果代表了检测的最终结果。2004年Tomoya Kono将WSSV从kuruma shrimp中纯化出来，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技术对此核酸进行扩增，以电泳观察LAMP结果。最后证实LAMP可用于WSSV相应序列的扩增，为虾的WSSV诊断打下了基础。2008年Lakshmi等用病毒吸附技术分离病毒，细胞培养液用蔗糖梯度超速离心方法获得模板，用RT-LAMP检测CHIK病毒。扩增结果可通过向反应管内加入SYBR Green I，根据显色来判断。2008年杨秋林等用醋酸可的松经皮下注射Wistar大鼠诱导Pc，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)经离心、加入裂解缓冲液、多次消化后提纯Pc基因组DNA，然后用环介导等温扩增(LAMP)技术检测卡氏肺孢子虫(Pc)，结果阳性Pc检测管经显色后呈绿色，阴性对照组均呈棕色。袁文等于2009年使用QIAamp viral RNA mini kit提取病毒的基因组RNA，建立小鼠肝炎病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测技术并进行初步应用。在检测扩增结果时，往LAMP反应管中加入SYBR Green I荧光染料显色，可见MHV阳性管变为绿色，而阴性管仍为染料原色橙色。这些研究表明，使用纯化过的病毒(病原)制备模板，通过LAMP扩增后可以通过向LAMP反应管中加入SYBR Green I荧光染料显色，用肉眼直接判断LAMP的扩增结果，简化了原来的通过电泳观察结果的步骤。