[发明专利]藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法

权利要求书

1.一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)采样：从雌性成年藏羚羊个体的耳部取1cm²皮肤组织，并将其放入装有贮存液的离心管中；

(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养：将所述步骤(1)所得的藏羚羊耳部皮肤组织依次经含有双抗的杜氏磷酸缓冲液浸洗、含有双抗的D/F12培养液冲洗后，将样本组织块放入35mm培养皿中，剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培养瓶中，均匀地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h后翻转培养瓶，加入3～5mL D/F12培养液继续培养10～18天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；

(3)传代与纯化：将所述步骤(2)所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用磷酸盐缓冲液清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；然后将所述消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养箱2～3min，取出，加入与消化液A等量的D/F12培养液终止消化，得到消化液B；将所述消化液B经离心、去上清液后，得到细胞沉淀物A；用D/F12培养液将所述细胞沉淀物A传入另一个培养瓶中，在37.5℃、含5％CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3～6天，得到生长至80％～90％汇合的皮肤成纤维细胞；

(4)细胞冻存：将所述步骤(3)所得的皮肤成纤维细胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混匀，先在4℃保存半小时，然后在-70℃冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；

(5)细胞复苏：将所述步骤(4)所得的冻存皮肤成纤维细胞放入37℃水浴中融化，吸出细胞悬液，用9倍所述细胞悬液体积的D/F12培养液进行洗涤，经离心、去上清后，得到细胞沉淀物B；用D/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可。

2.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中的贮存液为加入双抗的T20；所述加入双抗的T20是由占总溶液体积的20％的胎牛血清和80％的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7.2～7.4的溶液。

3.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)中的杜氏磷酸缓冲液是由0.8g/100mL的NaCl、0.0203g/100mL的KCl、0.1152g/100mL的Na₂HPO₄、0.0203g/100mL的KH₂PO₄、0.0134g/100mL的CaCl₂·2H₂O、0.01g/100mL的MgCl₂·6H₂O、0.0036g/100mL的丙酮酸钠、0.0075g/100mL的青霉素、0.005g/100mL的链霉素和0.1g/100mL的葡萄糖组成。

4.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)和(5)中的D/F12培养液均是由占总培养液体积的10％的胎牛血清、90％的D/F12和双抗组成。

5.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中的磷酸盐缓冲液是由0.8g/100mL的NaCl、0.02g/100mL的KCl、0.115g/100mL的Na₂HPO₄和0.02g/100mL的KH₂PO₄组成。

6.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中的冻存液是由占总溶液体积的20％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜、70％的D/F12和双抗组成。

7.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)和(5)中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为37.5℃、含5％CO₂的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。

8.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于：所述双抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素。