[发明专利]藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种成纤维细胞的培养，尤其涉及藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法。

背景技术

藏羚羊(Pantholops hodgsoni)隶属于偶蹄目牛科山羊亚科藏羚属，青藏高原特有物种，属国家一级保护动物和《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)中严禁进行贸易活动的濒危动物，主要分布在中国境内的青海、西藏、新疆三省的高寒荒漠化草原、高寒草原和高寒草甸地区，平均生活在海拔4100～5500m之间恶劣的环境中。由于环境因素导致深入研究藏羚羊存在着很大困难，目前关于藏羚羊的研究主要以宏观动物学研究为主，包括：动物行为、种群分布、个体生物学、系统发生学、寄生虫、疾病的诊断和治疗、羊绒的物理和化学性质等。关于藏羚羊分子生物学和细胞生物学的研究较少。鉴于此，建立藏羚羊细胞系以解决研究材料的问题十分必要。

细胞培养技术是生命科学研究领域的重要研究技术。现代生物技术中无论是基因治疗、干细胞、动物克隆都以细胞为载体进行。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。目前商品化的常用培养基包括MEM培养基系列、DMEM培养基系列、RPMI-1640培养基系列、199培养基系列、水解乳蛋白细胞培养基、F10、F12细胞培养基系列等。在众多培养基中，哪种培养基可以培养藏羚羊皮肤成纤维细胞以及建立藏羚羊皮肤成纤维细胞系的具体方法没有详细报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种获得藏羚羊皮肤成纤维细胞、为开展藏羚羊分子生物学和细胞生物学的相关研究提供研究材料的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤：

(1)采样：从雌性成年藏羚羊个体的耳部取1cm²皮肤组织，并将其放入装有贮存液的离心管中；

(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养：将所述步骤(1)所得的藏羚羊耳部皮肤组织依次经含有双抗的杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)浸洗、含有双抗的D/F12培养液冲洗后，将样本组织块放入35mm培养皿中，剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培养瓶中，均匀地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h后翻转培养瓶，加入3～5mL D/F12培养液继续培养10～18天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；

(3)传代与纯化：将所述步骤(2)所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，得到消化液A；然后将所述消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养箱2～3min，取出，加入与消化液A等量的D/F12培养液终止消化，得到消化液B；将所述消化液B经离心、去上清液后，得到细胞沉淀物A；用D/F12培养液将所述细胞沉淀物A传入另一个培养瓶中，在37.5℃、含5％CO₂的饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3～6天，得到生长至80％～90％汇合的皮肤成纤维细胞；

(4)细胞冻存：将所述步骤(3)所得的皮肤成纤维细胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混匀，先在4℃保存半小时，然后在-70℃冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；

(5)细胞复苏：将所述步骤(4)所得的冻存皮肤成纤维细胞放入37℃水浴中融化，吸出细胞悬液，用9倍所述细胞悬液体积的D/F12培养液进行洗涤，经离心、去上清后，得到细胞沉淀物B；用D/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可。

所述步骤(1)中的贮存液为加入双抗的T20；所述加入双抗的T20是由占总溶液体积的20％的胎牛血清(FBS)和80％的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7.2～7.4的溶液。