[发明专利]重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法

权利要求书

1.一种重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法，包括以下步骤：

(1)利用大肠杆菌表达生产重组肠道病毒71型病毒VP1蛋白，得到该蛋白的包涵体；

(2)按每1g包涵体∶15ml增溶液的比例，将包涵体溶解于增溶液中；所述增溶液的pH值为8.5，其组成及配比浓度为：盐酸胍4～6M、EDTA 1～10mM、Tris 5～20mM，余量为H₂O；

(3)在20～25℃的水浴和磁力搅拌条件下，向复性液中逐滴加入包涵体溶液，使复性液中的VP1蛋白浓度控制在0.1～1mg/ml；然后在15℃搅拌复性48小时；所述复性液的pH值为7.2，其组成及配比浓度为：PB 5～20mM，Arg 0.1～1mol/L，浓度为1～20％且分子量为5000～30000道尔顿的PEG。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：分段设计合成肠道病毒71型病毒VP1蛋白的基因片段，并于体外拼接成完整的核苷酸序列；拼接好的基因序列经测序验证正确后，按分子克隆方法构建重组表达质粒，然后由工程菌大肠杆菌发酵生产；发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体。

3.根据权利要求1或2任意一项中所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)复性液中的VP蛋白浓度控制在0.1～0.5mg/ml。

4.根据权利要求1或2任意一项中所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中增溶液的组成及配比浓度为：盐酸胍6M、EDTA 5mM、Tris 10mM，余量为H₂O。

5.根据权利要求1或2任意一项中所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)复性液中精氨酸浓度为0.1～0.3mol/L。

6.根据权利要求1或2任意一项中所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)复性液的组成及配比浓度为：PB 10mM，Arg 100mM，10％PEG20000，pH 7.2。

7.根据权利要求1或2任意一项中所述的纯化方法，其特征在于，包涵体蛋白经过稀释复性后，还进行亲和层析纯化。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析纯化包括：

在GE公司的XK 50/30柱中装入200mL的Chelating Sepharose Fast Flow凝胶，平衡缓冲液为20mM PB、0.5M NaCl、PH 7.0，洗脱缓冲液为20mM PB、0.5M NaCl、0.5M咪唑、PH 7.0；先用0.2M硫酸镍溶液平衡柱子，然后用平衡缓冲液平衡；将经过复性的复性液以20ml/min的流速上样于平衡好的柱子，上完样后用平衡缓冲液冲洗2个柱体积；然后以线性梯度洗脱，收集含目标蛋白的洗脱峰。