[发明专利]重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程重组蛋白的纯化方法。更确切地讲本发明是一种重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法。

背景技术

手、足、口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种急性传染病。该病自1957年首次报道以来，曾多次流行，世界卫生组织于2006年曾将本病列为第四位引起死亡的的疾病。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV71引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。

研究发现，引发手足口病的病毒有一个共同特点，均为肠道病毒科，为单股正链小RNA病毒。这些病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇病毒A组的16型、埃可病毒以及其它柯萨奇病毒。目前国内爆发的手足口病主要是由EV 71和Cox A16引起的。由柯萨奇病毒引起的手足口病一般症状较轻，而EV71则相对较重，20％的患者可以伴有引起无菌性或病毒性脑炎，心肌炎和脑麻痹后遗症的患者。因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。

EV71病毒的颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径大约在24～30nm。由EV71病毒基因组编码的分子量分别为34KD、30KD、26KD和7KD的多肽VP1、VP2、VP3、VP4，构成病毒的外壳。VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，因而抗原决定簇基本上位于VP1-VP3上。

其中，病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。

目前，基因重组的EV71衣壳蛋白VP1已经在原核和真核表达系统中得到表达。真核表达系统由于具有原核表达系统不具有的蛋白翻译后加工过程，因此表达的蛋白活性高；但同时也具有蛋白表达量低，生产周期长，生产成本高的缺点。原核表达系统虽然表达量高，生产周期短、成本低廉，但缺点是表达产物多以不溶解的包涵体形式聚集，蛋白回收率往往很低。

因此，提出一种成本低廉、工艺简便、蛋白回收率高的肠道病毒71型VP1抗原的纯化方法显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种重组肠道病毒71型VP1抗原的纯化方法。

为解决技术问题，本发明通过以下技术方案实现：是将肠道病毒71型VP1蛋白的编码基因插入原核表达载体中，通过大肠杆菌表达生产重组蛋白，经复性、纯化制备而成。

本发明中的重组肠道病毒71型病毒VP1抗原的纯化方法，包括以下步骤：

(1)利用大肠杆菌表达生产重组肠道病毒71型病毒VP1蛋白，得到该蛋白的包涵体；

(2)按每1g包涵体∶15ml增溶液的比例，将包涵体溶解于增溶液中；所述增溶液的pH值为8.5，其组成及配比浓度为：盐酸胍4～6M、EDTA 1～10mM、Tris 5～20mM，余量为H₂O。

(3)在20～25℃的水浴和磁力搅拌条件下，向复性液中逐滴加入包涵体溶液，使复性液中的VP1蛋白浓度控制在0.1～1mg/ml；然后在15℃搅拌复性48小时；所述复性液的pH值为7.2，其组成及配比浓度为：PB 5～20mM，Arg 0.1～1mol/L，浓度为1～20％且5000-30000道尔顿的PEG。

作为一种改进，所述步骤(1)包括：分段设计合成肠道病毒71型VP1蛋白的基因片段，并于体外拼接成完整的核苷酸序列；拼接好的基因序列经测序验证正确后，按分子克隆方法构建重组表达质粒，然后由工程菌大肠杆菌发酵生产；发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体。

作为一种改进，所述步骤(3)复性液中的蛋白浓度控制在0.1～0.5mg/ml。

作为一种改进，所述步骤(2)中增溶液的组成及配比浓度为：盐酸胍6M、EDTA 5mM、Tris 10mM，余量为H₂O。

作为一种改进，所述步骤(3)复性液中精氨酸浓度为0.1～0.3mol/L。