[发明专利]虎源性、豹源性DNA的PCR检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及虎豹的基因检测方法。尤其是虎豹基因的PCR检测方法及其中所涉及的特异性引物和相关试剂盒。

背景技术

虎、豹均是猫科豹属下的动物。虎是世界上体形最大的猫科动物，现存5个虎亚种，包括东北虎(Panthera tigris altaica)、苏门达腊虎(P.t.sumatrae)、华南虎(P.t.amoyensis)、印支虎(P.t.corbetti)和孟加拉虎(P.t.tigris)。目前，中国境内野生虎的数量已十分稀少。

豹在豹属的四种大型猫科动物(其余三种为狮、虎、美洲豹)中体积最小。豹的颜色鲜艳，有许多斑点和金黄色的皮毛，故又名金钱豹或花豹。

为了野生动物贸易能够持续发展，各国制定了相应的野生动物保护法规，禁止濒危动物的捕杀和贸易。国际上于1975年签署了《濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)》，中国于1981年加入该公约。尽管公约的成员国已达160个.野生动物非法狩猎和野生动物走私活动在世界各地仍非常猖獗.继续威胁着野生动物的生存。一些对虎豹皮、器官或制品有传统需求的民族通过新近的发展获得了新的经济水平，使得他们有足够的财力来获得挚爱的皮革、器官及其制品，这种需求极大地刺激了猫科动物的非法贸易，而国际间监管、执法的难度让保护力量显得过于苍白。

在野生动物取证过程中，有些情况下其产品经加工处理后失去了可辨认的形态特征，使虎豹制品的鉴定工作十分困难。由此可见，为了更有效地加强虎豹类的保护工作，建立一种可以对虎、豹DNA进行特异性检测的准确性高、实用性强的方法，从分子水平上对可疑的来自于虎、豹的样品(例如食品、药品、皮毛等)进行特异性检测鉴定，都是十分急需和必要的。

本研究中通过筛选虎、豹与其它动物在线粒体细胞色素b(Cyt b)基因片段的碱基差异合成特异引物，经过PCR扩增检测，达到了特异性检测鉴定虎、豹DNA的目的。由此建立了一种灵敏、特异、简便、快速、稳定性好的虎、豹DNA检测方法，为海关缉私、动物保护等提供了一个快速有效的检测平台。

发明内容

本发明的目的即在于提供方便、快速、灵敏地定量检测虎、豹DNA的PCR检测方法，以及检测中所使用的包含特异性引物序列的试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供虎源性、豹源性DNA的PCR检测引物，它们是：

引物序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5’GAATATACTATGGCTCCTACAC 3’，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5’GGTTGGCGGGGATGTAGTTA 3’。

在此基础上，本发明还提供虎源性、豹源性DNA的PCR检测试剂盒，所述的试剂盒包括检测溶液，该检测溶液中含有10×PCR缓冲液、10μmol/L正向引物、10μmol/L反向引物、10mmol/L dNTP、5U/μL Taq DNA聚合酶；其中，所述的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2。

本发明进一步提供了利用上述试剂盒检测虎源性、豹源性DNA的PCR检测方法，该方法使用上述试剂盒，包括如下步骤：

①提取待测样品DNA，得到模板DNA溶液；

②反应体系：取1μl步骤①制得的模板DNA溶液，加入上述试剂盒中的溶液6.2μl，再加入灭菌超纯水至总体积25μl；将以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min，离心10s；

③步骤②的反应体系按下述条件进行PCR检测：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

4℃保存反应产物。

本发明是采用PCR检测技术，对虎源性、豹源性制品的DNA进行鉴定。本发明所建立的对虎源性、豹源性DNA进行特异性检测的方法，除具有高特异性、灵敏性外，因其具有简便易行、快速、成本低等特点而更具有实用性。此方法为海关、动植物检疫以及动物保护组织提供了快速检测鉴定虎制品的有效方法。

非法出售的虎、豹制品可能都经过了加工处理过程，从而造成DNA的断裂和损失，显然也会影响检测的灵敏度。为了研究加工过程对检测灵敏度的影响，本实验采用加工烘烤过的虎肉粉进行灵敏度检测。本方法可以检测到经过这种处理后的样品，检测灵敏度是10pg/μL。

附图说明

图1虎、豹成分PCR特异性扩增结果；

图2虎源性成分PCR灵敏度检测扩增结果；