[发明专利]提供作物广谱病毒抗性的包含木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因的基因转移载体及其应用有效
申请号: | 201010203078.5 | 申请日: | 2010-06-10 |
公开(公告)号: | CN102277376A | 公开(公告)日: | 2011-12-14 |
发明(设计)人: | 叶锡东;龚怡蓉;王惠菁;王馨兰 | 申请(专利权)人: | 叶锡东;龚怡蓉;王惠菁;王馨兰 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;C12N1/21;C12N15/57;C12N5/10;A01H5/00;C12R1/01 |
代理公司: | 永新专利商标代理有限公司 72002 | 代理人: | 林晓红 |
地址: | 中国台*** | 国省代码: | 中国台湾;71 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 提供 作物 广谱 病毒 抗性 包含 木瓜 环斑 辅助 组分 蛋白酶 基因 转移 载体 及其 应用 | ||
技术领域
本发明涉及一种用于提供植物对于病毒的抗性的重组载体,其包含木瓜环斑病毒辅助组分蛋白酶基因(Papaya ringspot virus helper-componentprotease gene,PRSV HC-Pro gene)的编码序列片段。本发明也涉及一种重组微生物。本发明也涉及一种用于使植物对病毒具有抗性的方法。本发明也涉及辅助组分蛋白酶的全长基因或其基因片段用于制造对病毒具有抗性的植物的用途。
背景技术
木瓜(Carica papaya L.)为具有高度经济价值的作物,其病毒病害并无药剂可以治疗,近年来由于植物组织培养技术的提高,植物转基因技术的突破,加上病原诱导抗性理论(pathogen-derived resistance,PDR)(Sanford andJohnson 1985)的启示,将病毒基因组的一部分转移至宿主植物染色体内,已达到抗病毒感染的目的,已成为目前热门的方法。Fitch等人(Fitch et al.,1992)首先将PRSV夏威夷分离株的CP基因以微粒轰击(microprojectilebombardment)的方式转入木瓜中,但他们的转基因木瓜对于台湾系统的PRSV永康分离株(YK isolate)不具抗性,其依赖序列同源性的抗性成为此转基因木瓜在其他地区应用的限制因素。
申请人以前将台湾PRSV YK分离株的外壳蛋白(coat protein,CP)基因以农杆菌(Agrobacterium sp.)转移方式获得转基因木瓜株系(Cheng,1996),经攻击接种、分析后,证明这些转基因木瓜株系除了对台湾PRSVYK具有良好抗性外,对其他不同地区较疏远的PRSV病毒如夏威夷(HA)、墨西哥(MX)及泰国(TH)分离株也均有良好的抗性(Bau et al.,2003)。显示YK的外壳蛋白转基因木瓜对于PRSV提供很高程度的抗性(Bau et al.2004)。现有技术借助对外壳蛋白转基因木瓜的应用,虽然可得到抗病的转基因植物,其抗性原理为转移的CP基因激发木瓜防御反应作用的转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing,PTGS),使得木瓜产生分解入侵的PRSVRNA基因组的能力,而具有病毒抗性。但此原理有序列同源性专一性问题, 对于CP基因较疏远的PRSV不具抗性,这种病毒株系专一性抗性的缺点仍是普遍存在的问题(Tennant et al.2001),因此由不同株系病毒的外壳蛋白转基因植物仅具有区域性的应用价值。
申请人的研究团队利用农杆菌介导(Agrobacterium-mediated)的手段,将台湾PRSV YK系统的外壳蛋白基因导入木瓜未成熟胚中(Cheng et al.1996),得到对PRSV具不同程度抗性的株系,并且筛选出数个株系除了对本土的YK系统具良好抗性外,还对源自于夏威夷(HA)、泰国(TH)及墨西哥(MX)等不同地域的病毒均有良好的抗性(Bau et al.2003)。所得到的PRSVYK系统的外壳蛋白转基因木瓜株系经田间试验证实对于PRSV提供很高程度的抗性(Bau et al.2004)。
申请人于PRSV YK系统的外壳蛋白转基因木瓜的田间试验期间发现,结果发现PRSV YK外壳蛋白转基因木瓜会被超强的木瓜环斑病毒株击垮,而探讨其可击垮由外壳蛋白基因介导的抗性的原因为病毒蛋白辅助组分蛋白酶(helper-component protease,HC-Pro)造成。HC-Pro为基因沉默阻抑物(suppressor),其具有抑制转录后基因沉默作用的能力(Anadalakshmi et al.,1998;Brigneti et al.,1998;Shi et al.,1997),申请人推测PRSV 5-19的HC-Pro的抑制基因沉默的能力超强,可使得PRSV YK CP转基因木瓜的基因沉默机制被5-19HC-Pro所抑制,而无法发挥作用,从而使得转基因木瓜的抗性被抑制而失效。基于单独以外壳蛋白基因来提供抗性已不足以对付超强病毒株系(super virus strain)的事实,本技术领域特发展出对付超强病毒的新的转基因策略。
发明内容
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