[发明专利]海草喜盐草微卫星标记的筛选方法

权利要求书

1.一种海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，包括步骤：

1)使用改良的CTAB方法提取喜盐草叶片组织的基因组DNA；

2)应用生物素链霉亲和素捕获法得到含有微卫星的DNA片段，并对DNA片段进行测序，筛选2-6个碱基重复单元、重复数超过5个的DNA序列；

3)对上述步骤筛选出的重复序列两端的侧翼序列设计特异性的引物，并对不同地理分布群中的喜盐草个体基因组DNA进行PCR扩增以检测、优化引物；

4)对PCR产物片段大小进行分析，确定每个个体的基因型，获得喜盐草的遗传多态性图谱；和

5)确定重复性、稳定性和多态性高的微卫星标记。

2.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述改良的CTAB方法包括步骤：

1)将硅胶干燥并用75％乙醇擦拭干净的海草喜盐草干样在粉碎机粉碎；

2)向所述粉碎后的干样中加入预冷的洗脱缓冲液，混匀，所述洗脱缓冲液含有0.02g/ml的PVP和2.8μl/ml的β-巯基乙醇；

3)转移至离心管中，4℃，以12000转/分的速度离心15分钟后弃上清液，加入2×CTAB提取缓冲液、混匀，65℃水浴0.5-2小时，所述提取缓冲液含有2.8μl/ml的β-巯基乙醇；

4)加入等体积的体积比24∶1的氯仿-异戊醇、混匀，4℃，以12000转/分的速度，离心15分钟后，取上清液，重复数次；

5)在上述步骤取得的上清液中，加入RNAase，37℃水浴30分钟；

6)取出水浴，加入1/3体积的5M NaCl、2/3体积的冰异丙醇(-20℃)，混匀，-20℃沉淀2小时；

7)4℃，以12000转/分的速度离心15分钟后弃上清液，加入75％乙醇，将DNA从管底弹起，重复数次；

8)4℃，以10000转/分的速度离心15分钟后弃上清液，将管倒扣在干净的纸巾上；待管壁快干时将管正立，过夜；

9)加入灭菌超纯水，室温下溶解DNA。

3.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中，使用微卫星检索软件SSRHunter对序列进行筛选，并应用软件DNAstar中的MegAlign对含有微卫星的DNA序列进行聚类，选取聚类在不同contig中的序列设计引物。

4.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中，使用软件Primer Premier设计特异性的引物，设计的参数包括：(1)引物GC含量为40-60％，且正反向引物相差不超过10％；(2)退火温度大于45℃，且正反向引物相差不超过5℃；(3)正反向引物不能发生错配，且3′端避免互补重叠；(4)引物3′端不选择A，且不选择超过3个G或者C；(5)引物长度为18-27bp；(6)预期的PCR产物长度为100-300bp。

5.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增的反应体系为：以总体积20μl为基础，体系中包括：正反向引物各0.1μM、0.2mMdNTPs、1×PCR buffer(不含Mg2+)、1.5mM Mg2+、1U Taq酶和50ng模板。

6.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中，PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5分钟后进入循环，94℃变性30-60秒，根据不同的退火温度退火30-90秒，72℃延伸30-90秒，30-35个循环，72℃终延伸10分钟。

7.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中，对于PCR扩增的产物，用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性，筛选出多态性超过2个等位基因的引物对，并在正向引物标记荧光5′HEX、5′TAMRX、5′TET、5′ROX或5′6-FAM；再使用荧光标记引物进行PCR扩增，分析确定多态性。

8.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所述含有重复单元的序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。

9.根据权利要求1中所述的海草喜盐草微卫星标记的筛选方法，其特征在于，所筛选出的微卫星标记的特异引物分别为：

HO2：F：GAGGTCTTCGTATCGTCTG，R：GCATCTTGTGGTGGTTCT；

HO3：F：CGAGGCTATGTTCCAGAT，R：CAATGCCCAAGTAGGTGA；

HO5：F：GAATGGGAAGGTGAAAGAG，R：CACGGCACTGTTCATCTAC；

HO8：F：ATAACCAAAGCCTCCCAAGC，R：AAATATCAAACGCCCCTCAC；

HO20：F：AGAGGAAAAGAAAAGCGAG，R：ATGTCACGTGGGACCATAT；

HO30：F：CGCCGAAGGAAATGTGGAG，R：AACCCAACCGATCGACCCT；

HO31：F：GGTTGTGCGTGAGGTGAAT，R：ATACGCAGGTACGCACTCT；

HO36：F：CAACTAACCAAACGAGAAAC，R：AACCTTGACACCTGCTAATA；

HO48：F：ATCGAACCCAATAGACACCAG，R：CAGGCAACTTAGCAAGAAACT；

HO51：F：AGATAAGTTTCACTCCTGTG，R：ACCAGAACCAATCAAGAT。