[发明专利]海草喜盐草微卫星标记的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及海草喜盐草(Halophila ovalis(R.Br.)Hook.)微卫星标记的筛选方法和应用。 

背景技术

喜盐草(Halophila ovalis(R.Br.)Hook.)属于水鳖科喜盐草属的一种多年生海草，是海草中一种体型较小的广生性物种，广泛分布的印度-西太平洋区的潮间带至潮下带柔软的稀泥和粗糙的珊瑚礁中(C.den Hartog等，《海草的生物学、生态学和保护》，2006，第二章，25-50页)，在我国喜盐草主要分布于华南沿海的广西、广东、海南和香港的海草床(黄小平等，《科学通报》，2006，增刊Ⅱ，136-152页)。但是近年来，由于人类活动和自然环境等因素影响，海草床日趋衰退。随着人类对海草床的生态功能和经济功能的关注，喜盐草的种质资源鉴定、遗传多样性分析以及遗传图谱构建等研究工作逐渐深入，因此对喜盐草的分子遗传标记的需求也越来越多。 

不同的分子遗传标记因其多态性和检测变异能力的差异，所揭示的多样性程度存在较大的差异。早期的海草种群遗传学研究中，等位酶是最常用的分子遗传标记，而利用等位酶标记的海草研究中揭示的遗传多样性都很低。随着DNA分子标记的发展，人们发现海草的遗传多样性并不像等位酶标记揭示的那样低，甚至在一些种群中遗传变异还很高。然而，共显性遗传的微卫星标记相对于RAPD和AFLP而言，容易操作、重复性好，同时多态性高、选择中性、基因组出现频率高。但是由于缺乏喜盐草微卫星标记，喜盐草遗传学研究受到了一定的限制，所以十分需要获取喜盐草微卫星标记。 

发明内容

本发明的目的是提供一种喜盐草微卫星标记筛选方法，用以筛选出稳定性高、重复性好、多态性高的喜盐草微卫星标记。 

本发明目的是这样实现的：首先使用改良的CTAB(cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)方法提取喜盐草叶片组织的基因组DNA；再应用生物素链霉亲和素捕获法得到含有微卫星的DNA片段，且对DNA片段进行测序，筛选出碱基重复(2-6个)单 元多于5个的DNA序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计特异性的引物，并对不同地理分布群中的喜盐草样本基因组DNA进行PCR扩增以检测、优化引物；最后对PCR产物片段大小进行分析，确定每个个体的基因型，获得喜盐草的遗传多态性图谱，确定重复性、稳定性和多态性高的微卫星标记。 

本发明是按照以下操作技术完成的：首先使用改良的CTAB方法提取喜盐草叶片组织的基因组DNA。改良的CTAB方法包括步骤：1)将硅胶干燥并用75％乙醇擦拭干净的海草喜盐草干样在粉碎机粉碎；2)向所述粉碎后的干样中加入预冷的洗脱缓冲液，混匀，所述洗脱缓冲液含有0.02g/ml的PVP和2.8μl/ml的β-巯基乙醇；3)转移至离心管中，4℃，以12000转/分的速度离心15分钟后弃上清液，加入2×CTAB提取缓冲液、混匀，65℃水浴2小时，所述提取缓冲液含有2.8μl/ml的β-巯基乙醇；4)加入等体积的体积比24∶1的氯仿-异戊醇、混匀，4℃，以12000转/分的速度，离心15分钟后，取上清液，重复数次；5)在上述步骤取得的上清液中，加入RNAase，37℃水浴30分钟；6)取出水浴，加入1/3体积的5M NaCl、2/3体积的冰异丙醇(-20℃)，混匀，-20℃沉淀2小时；7)4℃，以12000转/分的速度离心15分钟后弃上清液，加入75％乙醇，将DNA从管底弹起，重复数次；8)4℃，以10000转/分的速度离心15分钟后弃上清液，将管倒扣在干净的纸巾上；待管壁快干时将管正立，过夜；9)加入灭菌超纯水，室温下溶解DNA。 

对于以改良的CTAB方法提取的喜盐草基因组DNA，采用生物素链霉亲和素捕获法获得含有微卫星的DNA片段，并对所得DNA片段进行测序；再使用微卫星检索软件SSRHunter对序列逐一查找，筛选出2-6个碱基重复单元、重复数超过5个的微卫星DNA序列；应用软件DNAstar中的MegAlign对含有微卫星的DNA序列进行聚类，选取聚类在不同contig中的序列设计引物。得到的含有重复单元的序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示。