[发明专利]鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及病毒疫苗株感染性克隆领域，具体地，涉及鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性克隆领域，更具体地涉及鸭病毒性肠炎病毒疫苗株感染性重组克隆系统，及其构建方法和应用。

背景技术

鸭病毒性肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭瘟病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疹病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒^[1]，而未能进一步将其进行分类。直到最近，其全序列才被全部测通^[2](GeneBank EU082088)。

自上世纪80年代开始用痘病毒作为活疫苗载体研究以来，用痘病毒、腺病毒和疱疹病毒等作为活疫苗载体的研究已有大量报道。疱疹病毒基因组巨大，非必须基因多，可容纳较大片段的外源基因的插入。但鸭病毒性肠炎病毒复制非必须区的研究到目前仍是空白。

发明内容

将疱疹病毒的基因组分段克隆到粘粒或质粒中，并用这些含有相互重叠区的基因组DNA片段转染相应细胞拯救出病毒是研究疱疹病毒的几种途径之一，且已有大量报道。本研究成功在DEV疫苗株基因组中筛选出3个复制非必须区。

具体内容如下：

1.构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，所述方法包括：

1)切断所述鸭病毒性肠炎病毒的DNA，

2)将切断后的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段连接到粘粒上，

3)选择多个粘粒组成所述鸭病毒性肠炎病毒感染性克隆系统，其中每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，和

4)将外源基因插入至少一个所述粘粒中的复制非必须区。

2.以上1所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，其特征在于所述粘粒是Fosmid，优选为pCC1 Fos。

3.以上1或2所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统的方法，其特征在于在所述鸭病毒性肠炎病毒是鸭病毒性肠炎病毒CVCCAV1222(GeneBank EU082088)。

4.以上1-3中任一项所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，其特征在于所述多个粘粒是5个粘粒，优选地，所述5个粘粒分别为pFOS1、pFOS2、pFOS3、pFOS4和pFOS5，其中克隆的鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段的序列分别为鸭病毒性肠炎病毒CVCCAV1222(GeneBank EU082088)的1-44551位、36852-75346位、69314-109887位、98197-129146位和119308-158091位。

5.以上1-4中任一项所述的构建鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒的方法，其特征在于所述复制非必须区位于pFOS1中的UL45和UL46基因之间，pFOS1中的UL41基因内，或pFOS5中的US7和US8基因之间。

6.根据以上1-5中任一项所述方法构建的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒。

7.一种鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒，其特征在于所述系统或试剂盒包括多个粘粒，每个粘粒中克隆有鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段，所述鸭病毒性肠炎病毒疫苗株基因片段含有相互重叠的区域，并拼接覆盖鸭病毒性肠炎病毒疫苗株全基因组，其中至少一个所述粘粒的复制非必须区中插入有外源基因。

8.以上6或7的鸭病毒性肠炎病毒感染性重组克隆系统或试剂盒用于构建重组鸭病毒性肠炎病毒的应用。

9.利用以上1-5中任一项的方法或利用以上6或7的系统或试剂盒获得的重组鸭病毒性肠炎病毒株，例如rDEVul4546，其保藏号为CCTCCV201012；rDEVus78，其保藏号为CCTCC V201010；和rDEVul41，其保藏号为CCTCC V201011。

10.以上9的重组鸭病毒性肠炎病毒株在制备用于预防所述鸭病毒性肠炎病毒感染所引起的疾病的药物中的应用。

在以上1中所述的方法中，步骤2)中的切断后的鸭病毒性肠炎病毒DNA片段可以通过在两端连接所述鸭病毒性肠炎病毒中所不含或只含有少数几个酶切位点的内切酶序列，诸如Fse I-Sbf I-Pme I接头而连接到粘粒上。