[发明专利]一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法

权利要求书

1.一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD；A2，重组腺病毒载体Ad-SCD的构建。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行以下操作：

A11，连接反应：将pGEM-T-SCD质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Xho I双酶切，双酶切反应体系为50μL；1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收纯化SCD小片段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度计测定产物浓度，用T₄ DNA连接酶于16℃连接过夜；

A12，连接产物转化及鉴定：取A11所得的连接产物10μL加入到含TOP10感受态细菌的离心管中，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速转移至冰上1-2min，加入800μL无抗性LB培养液，37℃温和震荡培养45min；取适量菌液涂布于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃孵育过夜；挑取小的单克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基中摇菌12-14h、200r/min，提取质粒，凝胶电泳检测后，进行Kpn I/Xho I双酶切鉴定。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A11连接反应体系为回收SCD片段，7.0μL；回收pAdTrack-CMV片段，10.0μL；10×T₄ DNA Ligase Buffer，2.0μL；T₄ DNA连接酶，1.0μL；总体积20.0μL。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2具体执行以下操作：A21，制备含骨架载体pAdEasy-1的感受态BJ 5183菌；A22，穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化；A23，同源重组。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A21具体执行以下操作：(1)取100μL BJ5183菌液加入到5mL无抗性液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.3-0.4；(2)将菌液置冰上冰浴20min，4℃，4000r/min离心10min；(3)倒掉菌液，将离心管倒置于干净吸水纸上除去残液，加入0.5mL 0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，补充至20mL，混匀后冰浴20min；(4)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，混匀后冰浴20min；(5)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴20min；(6)在感受态菌液中加入终浓度10％的甘油，每管200μL分装后-70℃保存备用。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A22具体执行以下操作：将鉴定正确的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD质粒用PmeI酶切线性化，反应体系如下：10×NEB Buffer 4，5.0μL；质粒pAdTrack-CMV-SCD，≤2μg；100×BSA，0.5μL；Pme I酶，1.0μL；余量dd H₂O至总体积50.0μL。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A23具体执行以下操作：将穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化产物，直接转化含腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183，进行同源重组；而后接种于含卡那抗性的LB平板上，37℃孵育过夜，通过平板初步筛选鉴定具有重组子的菌落，进行小量培养后，制备质粒DNA，用内切酶Pac I酶切鉴定。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，Pac I反应体系如下表：10×NEB Buffer 1，2.0μL；重组质粒Ad-SCD，≤1.0μg；100×BSA，0.2μL；Pac I，0.5μL；余量dd H₂O至总体积20.0μL；酶切反应条件：放置37℃水浴酶切16h；1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。