[发明专利]一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法。

背景技术

腺病毒载体具有转染效率高、感染细胞范围广、病毒滴度高等优点，可感染处于细胞周期中的静止期和分裂期细胞，同时可介导基因的体内外转移，是一种高效的基因转移载体。构建重组腺病毒载体并在293细胞中包装成熟病毒颗粒是应用腺病毒作为媒介表达目标基因的前提。绿色荧光蛋白(GFP)是试验中广泛应用的一种蛋白指示剂，可作为观察测定病毒感染和外源基因表达水平以及检测生物安全和载体示踪的标记蛋白。

SCD是一种膜结合蛋白，在牛、小鼠及人上的结构基本一致。目前，多个物种的SCD基因相继被分离，包括人、小鼠、大鼠、猪、鸡、绵羊和山羊等。山羊SCD基因cDNA全长5123bp，包含1080bp的开放阅读框，编码359个氨基酸，有6个外显子和5个内含子，位于山羊染色体26q21区域。SCD基因一共发现存在5种亚型，在脂质代谢中具有重要意义，对体内三酰甘油、胆固醇酯、磷脂和蜡酯等的合成起关键作用，SCD的调控对维持机体正常生理状态和体内脂质内环境的稳定意义重大。SCD的表达及活性受到多种因素的影响，包括饲粮的成分、激素的不平衡、动物发育阶段、温度变化、维生素、酚类化合物等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法。

一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：A1，构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD；A2，重组腺病毒载体Ad-SCD的构建。

所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行以下操作：

A11，连接反应：将pGEM-T-SCD质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Xho I双酶切，双酶切反应体系为50μL；1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收纯化SCD小片段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度计测定产物浓度，用T₄ DNA连接酶于16℃连接过夜；

A12，连接产物转化及鉴定：取A11所得的连接产物10μL加入到含TOP10感受态细菌的离心管中，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速转移至冰上1-2min，加入800μL无抗性LB培养液，37℃温和震荡培养45min；取适量菌液涂布于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃孵育过夜；挑取小的单克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基中摇菌12-14h、200r/min，提取质粒，凝胶电泳检测后，进行Kpn I/Xho I双酶切鉴定。

所述的构建方法，所述步骤A11连接反应体系为回收SCD片段，7.0μL；回收pAdTrack-CMV片段，10.0μL；10×T₄DNA Ligase Buffer，2.0μL；T₄ DNA连接酶，1.0μL；总体积20.0μL。

所述的构建方法，所述步骤A2具体执行以下操作：A21，制备含骨架载体pAdEasy-1的感受态BJ5183菌；A22，穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化；A23，同源重组。

所述的构建方法，所述步骤A21具体执行以下操作：(1)取100μLBJ5183菌液加入到5mL无抗性液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.3-0.4；(2)将菌液置冰上冰浴20min，4℃，4000r/min离心10min；(3)倒掉菌液，将离心管倒置于干净吸水纸上除去残液，加入0.5mL0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，补充至20mL，混匀后冰浴20min；(4)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，混匀后冰浴20min；(5)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴20min；(6)在感受态菌液中加入终浓度10％的甘油，每管200μL分装后-70℃保存备用。

所述的构建方法，所述步骤A22具体执行以下操作：将鉴定正确的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD质粒用Pme I酶切线性化，反应体系如下：10×NEB Buffer 4，5.0μL；质粒pAdTrack-CMV-SCD，≤2μg；100×BSA，0.5μL；Pme I酶，1.0μL；余量dd H₂O至总体积50.0μL。