[发明专利]南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法

权利要求书

1.南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：

a、从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；

b、将总RNA稀释成RNA溶液；

c、以RNA溶液作为模板，进行RT-Real time PCR反应；在RT-Real time PCR反应体系中包括扩增引物、荧光探针；其中扩增引物共三组，分别为引物ArMV、引物BYMV和引物LSV，分别具有如下序列：

上游引物ArMV-F：5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′，

下游引物ArMV-R：5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′，

上游引物BYMV-F：5′-GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3′，

下游引物BYMV-R：5′-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3′，

上游引物LSV-F：5′-GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3′，

下游引物LSV-R：5′-GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3′，

引物ArMV、引物BYMV和引物LSV分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作，

其中荧光探针共三种，分别为探针ArMV-P、探针BYMV-P和探针LSV-P；其中

探针ArMV-P是5′端5-羧基荧光素修饰、3′端5-羧基四甲基罗丹明修饰的序列：

5′-FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3′，

探针BYMV-P是5′端六氯-6-甲基荧光素修饰、3′端5-羧基四甲基罗丹明修饰的序列：

5′-HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3′，

探针LSV-P是5′端5-羧基-X-罗丹明修饰、3′端暗粹灭剂修饰的序列：

5′-ROX-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3′，

探针ArMV-P、探针BYMV-P和探针LSV-P分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒高度保守的衣壳蛋白基因序列设计；

d、实时对RT-Real time PCR产物进行荧光阳性检测；

e、根据荧光阳性检测结果，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

2.根据权利要求1所述的南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于步骤d包括采用空白对照对RT-Real time PCR反应稳定性检测的步骤；反应结果为阴性则说明RT-Real time PCR反应稳定正常，反应结果为阳性则说明RT-Real time PCR反应不稳定、可能受到污染，需要重新检测。

3.根据权利要求1所述的南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于步骤d还包括采用阴性对照对RT-Real time PCR反应稳定性检测的步骤；反应结果为阴性则说明RT-Real time PCR反应稳定正常，反应结果为阳性则说明RT-Real time PCR反应不稳定、可能受到污染，需要重新检测。

4.根据权利要求1所述的南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于所述RT-Real time PCR反应中，扩增循环次数为40次。

5.根据权利要求1所述的南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于b步骤中的RNA溶液浓度大于等于总RNA浓度的10^-2倍。

6.南芥菜花叶病毒的扩增引物，其特征在于，上游引物和下游引物分别具有如下序列：

上游引物：5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′，

下游引物：5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′。