[发明专利]南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒物种检测技术，具体涉及南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的快速检测技术。

背景技术

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)和百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)三种病毒是侵染百合和唐菖蒲的主要病原物，给种植者带来较大的经济损失。南芥菜花叶病毒寄主范围广泛，可以侵染约174属215种植物，自然侵染并危害多种花卉、瓜类、豆类和果树，引起花叶、黄化褪绿、矮化、皱缩甚至坏死等症状，为我国规定的进境植物检疫性有害生物。BYMV病毒寄主广泛，主要寄主为唐菖蒲等观赏植物和豆科植物。受BYMV侵染的唐菖蒲幼苗生长势减弱，叶片出现白色碎斑，花杂色，导致切花质量下降，种球产量减少，而受BYMV侵染的蚕豆，种传率4％～17％，田间发病率可高达67％～100％，造成59％～96％的产量损失。百合受LSV的侵染率高达73％，其单独侵染时一股无明显症状，在自然条件下常与其它病毒复合侵染，导致百合叶片严重花叶和整株矮化，影响百合的产量和商业价值。

南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒检测可采用常规的酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测，但这种检测方法灵敏度低，存在偏差；特别是当唐菖蒲和百合处于休眠状态时，种球中病毒浓度较低，采用常规的酶联免疫吸附检测方法(ELISA)则不能检出。邓丛良等根据ArMV不同分离物外壳蛋白基因的保守序列，设计特异性检测引物和探针，建立了检测ArMV的实时RT-PCR检测方法，例如中国专利CN1952649A，有效的解决了酶联免疫吸附检测方法(ELISA)灵敏度低的技术缺陷。

工作人员利用实时RT-PCR检测技术对侵染百合和唐菖蒲的三种主要病原物(南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒)检测时，需要做三次检测实验，速度慢，因此需要改进。

发明内容

本发明所要解决的是南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的检测速度慢的技术问题。

解决上述问题采用如下技术方案：南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

a、从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；

b、将总RNA稀释成RNA溶液；

c、以RNA溶液作为模板，进行RT-Real time PCR反应；在RT-Real time PCR反应体系中包括扩增引物、荧光探针；其中扩增引物共三组，分别为引物ArMV、引物BYMV和引物LSV，分别具有如下序列：

上游引物ArMV-F：5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′，

下游引物ArMV-R：5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′，

上游引物BYMV-F：5′-GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3′，

下游引物BYMV-R：5′-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3′，

上游引物LSV-F： 5′-GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3′，

下游引物LSV-R： 5′-GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3′，

引物ArMV、引物BYMV和引物LSV分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作，

其中荧光探针共三种，分别为探针ArMV-P、探针BYMV-P和探针LSV-P；其中

探针ArMV-P是5′端5-羧基荧光素修饰、3′端5-羧基四甲基罗丹明修饰的序列：5′-FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3′，当探针与靶序列配对时，FAM荧光基团发射的荧光因与3′端的TAMRA淬灭剂接近而被淬灭，在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得FAM荧光基团与淬灭剂TAMRA分离，发射荧光，

探针BYMV-P是5′端六氯-6-甲基荧光素修饰、3′端5-羧基四甲基罗丹明修饰的序列：5′-HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3′，当探针与靶序列配对时，HEX荧光基团发射的荧光因与3′端的TAMRA淬灭剂接近而被淬灭，在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得HEX荧光基团与淬灭剂TAMRA分离，发射荧光，