[发明专利]一种7-木糖紫杉烷糖基水解酶、其基因的核苷酸序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种水解酶及编码该酶的核苷酸序列，具体讲，涉及一种专一性水解紫杉烷木糖苷的7-木糖紫杉烷糖基水解酶及其核苷酸序列，以及应用。

背景技术

紫杉醇(Paclitaxel)主要由红豆杉属植物产生，作为二十世纪90年代抗癌药的重要成就之一，自问世以来，其独特的抗肿瘤机制和显著的抗肿瘤活性令世人瞩目[Kingston DGI，et al.The taxane diterpenoids.In：Herz W，et al.eds.Progress in the chemistry of organic natural products.New York：Springer-Verlag，1993，161-165]。它可以与微管蛋白结合，促进微管蛋白的聚合并抑制其解聚，阻止细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成，使细胞停滞于G2期和M期。目前紫杉醇在临床上被用作乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等的一线药物。对头颈部癌症、黑色素瘤、结肠癌以及由HIV引起的卡波济肉瘤也有较好的疗效。

紫杉醇在红豆杉植株中含量很低，即使是含量最高的部位树皮中也只有万分之二左右[美国专利US 6028206]。如果以红豆杉树皮为原料，每提取1公斤紫杉醇就需要10吨树皮(相当于2000棵左右的树木)！而满足1例病人的用药量相当于毁掉3-4棵百年老树。目前，灌木型红豆杉杂交种的苗圃栽培被认为是已知的解决紫杉醇来源最简易、资源可再生、成本最低廉的方法。另外，1988年法国Denis等从欧洲红豆杉的针叶中得到含量为0.1％的紫杉醇前体化合物10-去乙酰巴卡亭III(10-deacetylbaccatin III)，以此为前体半合成了紫杉醇，并研制出比紫杉醇抗肿瘤活性更强、有更好水溶性的多烯紫杉醇Taxotere[Denis JN，Greene AE.J.Am Chem Soc 1988，110(17)：5917-5919；Ringel I，Horwitz SB.J Nat Cancer Inst 1991，83(4)：288-291]。

尽管红豆杉植株中紫杉醇的含量非常低，但具有紫杉醇母核结构的C-7木糖紫杉烷类化合物(紫杉烷木糖苷)，包括7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol，XDT)、7-木糖-10-去乙酰巴卡亭III(7-β-xylosyl-10-deacetylbaccatin III，XDB)、7-木糖-10-去乙酰三尖杉宁碱(7-β-xylosyl-10-deacetylcepholomanine，XDC)等，却含量丰富，例如，7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-β-xylosyl-10-deacytyltaxol，XDT)的含量可达紫杉醇的10倍以上，在红豆杉Taxus wallichiana的树皮中，XDT的收率甚至可高达0.5％[美国专利US6028206]。这些在红豆杉材料中大量存在的紫杉醇类似物如果采用化学或生物方法去除其木糖基，产生C-7位羟基化产物，用于制备紫杉醇或多烯紫杉醇、或其中间体，则可以达到提高红豆杉资源利用率的目的。而这方面的研究已经取得了一些进展。

但化学方法存在许多不足，如：在高碘酸盐的氧化过程中容易导致7-木糖紫杉烷其他侧链的降解，收率低，反应过程较繁琐，对环境有污染等。生物方法则由于符合“绿色化学”的理念而越来越收到重视。

美国及欧洲专利[US005700669A；EP0668360A1]及发表的相关论文[Hanson，RL，et al.Biotechnol Appl Biochem 1997，26：153-158]公开了利用细菌Moraxella sp.、Bacillus macerans、Bacillus circulans和Micrococcus sp.将C-7木糖紫杉烷转化为C-7羟基紫杉烷的水解方法。其中，Moraxella sp.(ATCC55475)的转化能力最强，在2ml细胞悬浮液中加入0.5mg 7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)(湿细胞91.5mg/mL；XDT0.25mg/ml)，28℃、12rpm条件下极向(end-over-end)混合21小时，没有XDT剩余，HPLC检测到产物DT的产率为0.23mg/ml。在另一个实验中，2ml反应悬浮液中的62.5mg湿菌体在7小时内可将0.5mg XDT几乎完全转化为DT。