[发明专利]鲤鱼背肌中组织蛋白酶L的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于酶分离纯化技术领域，涉及一种鲤鱼背肌中组织蛋白酶L的分离纯化方法。

背景技术

组织蛋白酶cathepsin是在各种动物组织的细胞内(特别是溶酶体部分)发现的一类蛋白酶。此名源自希腊语的“消化”，为威尔斯达特(R.Willstāatter，1929)命名的。它是广泛存在于病毒、细菌、真菌、原生动物及原虫、植物、哺乳动物和人的溶酶体内的一种酶，属于胞内蛋白酶。弱酸性环境中易被活化，是一类在碱性和中性溶液中不稳定的糖蛋白(除组织蛋白酶D、E、S外)。到目前为止，组织蛋白酶A到Z都有报道，基本是按照发现的顺序命名的。按组织蛋白酶的催化活性中心可分为三种，丝氨酸蛋白酶(如A、G、R)、天冬氨酸蛋白酶(如D、E)和半胱氨酸蛋白酶(如B、C、H、L、S等)。

组织蛋白酶L(cathepsin L CL)属于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，以酶原的形式贮存于生物体的溶酶体中，相对分子质量为30000。在正常情况下，大约10％的酶原被生理性分泌至胞质，然后可被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，切除N端和C端多余的氨基酸残基形成相对分子质量为24000的活性形式，参与许多特殊的生理过程，如激素原的激活、抗原呈递、组织器官的发育等。

对于人类而言，在病理状态下，各种原因所致的细胞损伤(如病原微生物、炎症因子、氧化应激等)，导致溶酶体膜稳定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CL释放到胞质或组织间隙，并被激活，可降解细胞成分或细胞间质基质成分，包括层粘素、IV型胶原纤维及纤维连接素等，与人类许多疾病如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、阿尔茨海姆病、多发性硬化症及其他慢性炎症性疾病有关。纯化CL并研究其各种性质，有助于针对各类CL相关病症研发专用药物。

在鱼类的加工过程中，特别是鱼糜加工、贮运过程中，与其他组织蛋白酶相比，CL活性高、稳定性强，能够降解鱼肉、鱼糜蛋白质的主要组成成分肌原纤维，导致鱼肉、鱼糜品质劣化。为了有效抑制或消除CL的劣质影响，分离纯化出CL，充分研究其酶学性质，具有重要的学术价值；对于实际生产中有效指导筛选其有效可食性抑制剂具有重要意义。

另一方面，分离纯化出CL也有助于今后充分利用其高效蛋白水解性能，开发食品嫩化剂、饲料酶制剂、洗涤日用酶制剂以及化妆领域专用酶制剂。

目前国内外对于淡、海水鱼类内脏中的CL纯化已见报道，但是鱼类加工过程中内脏一般都会去除，对肉质有影响作用的应该是肌肉中的CL。目前对于鲤鱼背肌中CL的分离纯化尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种从鲤鱼背肌中分离纯化组织蛋白酶L(CL)的方法。利用本发明的方法可以获得凝胶电泳检测单一组分的CL。

本发明包括如下步骤：

步骤(1)取鲤鱼背肌白肉a克，加入b毫升的20毫摩尔/升(mM)Tris-盐酸缓冲液匀浆，在离心机转子温度为3～5℃、6000×g～6500×g条件下离心15～20min，得到上清液；所述的Tris-盐酸缓冲液pH为6.8～7.5，a∶b＝1∶5～10；

步骤(2)将上清液于55～65℃条件下加热3～5min，置于冰水冷却，在离心机转子温度为3～5℃、8000×g～8500×g条件下离心15～20min，获得粗酶液；

步骤(3)将得到的粗酶液经过疏水性凝胶层析，收集具有活性的组分并合并；所述的活性的组分由CL专一性底物(Z-Phe-Arg-MCA)活性测定方法得到；

步骤(4)将合并后的活性的组分经过离子交换层析，再次收集具有活性的组分并合并；

步骤(5)加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到70％，离心获得沉淀；

步骤(6)在得到的沉淀中加入的MacIlvaine缓冲液复溶，得到高浓度的部分纯化酶液；所述的MacIlvaine缓冲液复溶pH为2.5～3.5；

步骤(7)进行超滤浓缩，去除比CL分子量低的蛋白质；

步骤(8)进行体积排阻高效液相(SEC-HPLC)分离，最终获得CL；

对获得的纯化酶进行了酶学性质检验，其催化底物选择性实验结果表明该纯化酶只能催化水解CL的专一性底物Z-Phe-Arg-MCA；最适pH为5.5，最适温度为60℃；能够被CL的专一性抑制剂E-64完全抑制活性，被激活剂DTT、EDTA所激活；以上结果证实了按本发明的操作步骤所获得的纯化酶为组织蛋白酶L(CL)。

本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是：