[发明专利]一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体及其构建方法。

背景技术

随着生物技术的进步，人们利用基因工程手段来改造植物以提高其品质、产量和抗性水平等已经成为现实。尤其近年来，转基因技术突飞猛进，转基因作物越来越多。基因修饰食品的安全性问题便成为公众关注的热点之一。由于某些原因，人们往往不希望在某种植物器官中含有外源的基因。特别是在一些可食用部分，例如，果实、种子，若含有某种外来基因，该基因产物可能不利于食用器官的品质改良，或可能不利于产品在市场上销售，就有必要将这些外源基因在食用器官删除。因此，如何控制转基因植物中外源基因的行为对转基因作物的产业化和商业化具有非常重要的意义。

随着分子生物学的不断发展，人们已经开始利用基因工程手段来控制转基因的行为。例如，Park&Willmizter等使用马铃薯块茎专一性启动子与uidA基因融合，所获转基因马铃薯只在块茎组织中检测到uidA基因的活性，而根、茎、叶中检测不到uidA基因的活性。

专利号为CN00122803.X的中国发明专利公开了一种利用定位重组系统从特定器官中删除外源基因的方法，该方法包括以下步骤：分别构建含重组酶基因的植物表达载体与含外源目的基因的载体，重组酶基因受器官或组织特异性启动子驱动，外源目的基因受组成型启动子驱动，外源目的基因两侧为同向的可被重组酶识别的DNA位点，将这两种载体通过转基因的方法分别导入两个植株，这两个转基因植物杂交后，重组酶识别外源目的基因两侧的DNA位点，将外源目的基因从植物基因组中删除。虽然该发明所述方法从理论上讲，重组酶在植物的特异器官或组织中表达，并在表达的器官或组织中切出识别位点间的外源核苷酸序列，而在其它器官或组织中不能删除外源靶核苷酸序列并保证了该外源基因的性状；但在实际操作过程中，需要将含重组酶基因的植物表达载体与含外源目的基因的载体分别导入植物细胞中，待转基因植物成活并发育良好再将二者杂交，缺点是操作复杂，转化及筛选工作量大，所需时间长，并且这种方法容易引起细胞变异，而且导入的基因又不是紧密连锁的，在后代中基因间会出现难以解决的孟德尔分离。

另外，在表达载体构建完成之后，将其导入农杆菌，在农杆菌培养过程中也会有Cre蛋白的表达而造成许多农杆菌中失去完整的Cre-LoxP系统，不仅载体构建过程中存在困难，也会降低农杆菌转化植物效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体。

本发明的第二个目的在于提供一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体的构建方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种可高效删除转基因植物选择标记基因的表达载体，所述表达载体含有Cre基因表达盒、选择标记基因表达盒以及驱动目的基因的启动子、目的基因的终止子和供目的基因插入的多克隆位点；所述Cre基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述Cre基因表达盒和选择标记基因表达盒位于两个同向的loxP位点之间。

在Cre基因的第302位碱基G和第303位碱基G之间插入有碱基序列如SEQ IDNO：2所示的蓖麻过氧化氢酶基因的内含子序列。

SEQ ID NO：2：

1   GTAAATTTCT AGTTTTTCTC CTTCATTTTC TTGGTTAGGA CCCTTTTCTC TTTTTATTTT

61  TTTGAGCTTT GATCTTTCTT TAAACTGATC TATTTTTTAA TTGATTGGTT ATGGTGTAAA

121 TATTACATAG CTTTAACTGA TAATCTGATT ACTTTATTTC GTGTGTCTAT GATGATGATG

181 ATGTTACAG

Cre基因经突变改造不存在的BamHI位点位于Cre基因的356位(将357位的G突变为A后，GGATCC变为GAATCC)改造后的Cre基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其中斜体且加粗部分为插入的蓖麻过氧化氢酶基因内含子，下划线位置为点突变碱基：

1   ATGTCCAATT TACTGACCGT ACACCAAAAT TTGCCTGCAT TACCGGTCGATGCAACGAGT

61  GATGAGGTTC GCAAGAACCT GATGGACATG TTCAGGGATC GCCAGGCGTTTTCTGAGCAT