[发明专利]乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法

权利要求书

1.乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于：该疫苗是由乙肝病毒表面抗原即HBsAg和B细胞激活因子即BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物型疫苗。

2.根据权利要求1所述乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于：所述HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点即IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBsAg全长cDNA和BAFF全长cDNA。

3.根据权利要求1或2所述乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于：所述HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。

4.权利要求1所述乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建：将HBsAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体；

b、免疫刺激复合物的制备：将HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的免疫刺激复合物。

5.根据权利要求4所述乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤a的具体方法为：

a1、HBsAg全长cDNA的克隆：提取乙肝病毒转基因小鼠的肝脏细胞总RNA，逆转录得到cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBsAg全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-HBsAg；

a2、BAFF全长cDNA的克隆：提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH I和Sal I酶切位点的BAFF全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-BAFF；

a3、重组真核载体的构建：自步骤a1所得重组载体pT-HBsAg中用Pst I和EcoR I双酶切出HBsAg全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，得重组载体pStar-HBsAg；再自步骤a2所得重组载体pT-BAFF中用BamH I和Sal I双酶切出BAFF全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBsAg连接，即得HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体pStar-HBsAg-IRES-BAFF。