[发明专利]乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及乙肝病毒表面抗原的免疫增强型基因疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。

背景技术

乙肝病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型肝炎是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。大量研究证明，乙肝病毒表面抗原(HBsAg)所诱导产生的抗HBSAg抗体是一种保护性抗体，具有阻断HBV感染的能力。因此，运用HBsAg疫苗免疫机体，能有效防止HBV感染的风险，可以显著降低肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌等肝脏疾病的发生率。

B细胞激活因子(BAFF)是B细胞存活与成熟的必需因子，为肿瘤坏死因子(TNF)家族成员。其能够增强B细胞、CD4T细胞、NK细胞的活性，使机体的免疫应答增强；还可作为T细胞激活的共刺激因子，刺激T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)，上调CD25(IL-2受体α链)表达，并以IL-2依赖方式促进T细胞增生。

免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成的一种直径为30～40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈细胞的吞噬。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBsAg的免疫增强型基因疫苗；目的之二在于提供所述HBsAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、HBsAg的免疫增强型基因疫苗，该疫苗是由HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的ISCOM型疫苗。

进一步，所述HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点(IRES)的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBsAg全长cDNA和BAFF全长cDNA；

进一步，所述HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。

2、所述HBsAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：

a、HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建：将HBsAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将BAFF全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体；

b、ISCOM的制备：将HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBsAg和BAFF双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM。

进一步，所述步骤a的具体方法为：

a1、HBsAg全长cDNA的克隆：提取HBV转基因小鼠的肝脏细胞总RNA，逆转录得到cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBsAg全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-HBsAg；