[发明专利]一种检测荧光量子点在生物体内毒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测荧光量子点在动物体内毒性的方法，属于纳米材料技术领域。

背景技术

量子点(quantum dots，QDs)也称半导体纳米微晶体，由于其具有的半导体特性和独特的光学性质，特别是其作为一种新型的荧光探针，激发光波段范围宽、发射光谱宽度窄、荧光强度高、稳定性好以及寿命较长等优点明显优越于传统的有机染料和荧光蛋白。因此，使其在光电材料，医学和生命科学领域得到了广泛的运用。目前应用最多的量子点是一种以CdSe、CdTe等为核，ZnS、ZnSe等作为表面薄层的壳结构，此结构具有较高的发光产率和较好的光化学稳定性。但是作为含有重金属元素的纳米材料，在应用的过程中，这些重金属对动物生存环境和生命过程的各个方面都可能产生潜在不利影响。为了量子点能广泛地应用于生命科学等领域，近年来，量子点的生物学毒性效应及其对环境的影响成为新的研究热点。

量子点在生命科学领域应用的过程中，需要一种有效的对其毒性进行评估的方法。当前检测量子点在生物体内毒性的方法主要有探讨量子点对细胞活性和细胞遗传毒性的影响；不同量子点被注射到生物体内的动力学行为；量子点释放的重金属元素对细胞或动物的正常代谢活动的影响。我们经过检索，发现现有技术主要集中在探讨量子点对细胞形态变化的影响及其在生物体内的分布。例如：DUBERTRET等将CdSe/ZnS-QDs用聚合磷脂酰乙醇胺和卵磷脂混合物包裹成胶囊，注射到非洲蟾蜍胚胎细胞，用显微镜观察发现CdSe/ZnS-QDs引起细胞异常(“科学”杂志，2002年298期第1759页-1762页)。Lovric 等研究了不同粒径和表面电荷的CdTe量子点在PC12细胞中的分布，结果表明：CdTe粒径大小不同使其在细胞器中的分布不同(“J Mol Med”，2005年83期第377页-385页)。Yang等将PEG-ZnS/CdTe通过尾静脉注射至小鼠体内，用荧光显微镜观察，发现其主要富集在肝脏和脾脏(“环境健康展望期刊”Environ Health Perspect，2007年9期第1339页-1343页)。Robe等将CdSe/ZnS-QDs量子点注射到小鼠皮下，用荧光显微镜察检查发现注射后5min-24h内量子点主要在腋淋巴结中，但血浆、尿液、粪便中未检测到(‘BMC Cancer”2008年第8期)；Kirchner等通过量子点染毒前后贴壁生长细胞数目和ICP-AES测定，研究了量子点CdSe和CdSe/ZnS的毒性与Cd²⁺释放的关系。结果发现：细胞毒性随着体系中Cd²⁺浓度的增加而增大，微量的镉即可通过与含羧基、氨基、特别是含巯基的蛋白分子结合来抑制线粒体中多种酶的活性，分析说明量子点在生物体内存在潜在的毒性(Nano Lett，2005，5(2)：331-338)。以上各方法操作复杂，需要贵重仪器，价格昂贵，检测样品多，重复性差等缺点。因此，需要建立一种通用、操作简便、快速，易于重复，可信度较高和稳定好的检测方法，来考察量子点在生物体内的安全性，从而有利于量子点能在生命科学领域中的得到应用。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种用于检测荧光量子点在生物体内毒性的方法。

本发明研究发现，金属硫蛋白(Metallothionein，简称MT)对含重金属的荧光量子点非常敏感，当含有重金属的荧光量子点进入体内后，重金属将诱导金属硫蛋白mRNA的转录，从而可以反映其对生物体的影响。因此，MTmRNA的含量变化能有效地评价生物体中含重金属的量子点对生物体的毒性。

本发明提供检测金属硫蛋白基因的表达来评价荧光量子点在生物体内的毒性。

本发明的检测方法是利用荧光量子点中的重金属诱导生物体内MTmRNA的转录，检测MTmRNA量的表达，从而反映荧光量子点对生物体的毒性。其包括如下步骤：

1)根据待测动物和量子点中所含的重金属来设计合成MT引物；

2)提取待测动物样品mRNA；

3)将mRNA逆转录成cDNA；

4)利用设计的引物进行PCR扩增；

5)检测扩增产物，根据MTmRNA含量，分析量子点对待测动物的毒性大小。

更具体地，可采用如下步骤：

一、MT引物设计与合成

根据待测动物和量子点中重金属不同，在NCBI中检索出MT基因的全长序列，用premier premier5设计MT扩增引物，生物合成公司合成序列。

二、总RNA提取

1、取待测样品(≤30mg)，加入1mL RNArose reaqent，匀浆。