[发明专利]腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法

权利要求书

1.一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成：

(1)构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体

采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，获得的阳性克隆命名为pUC19M，采用聚合酶链式反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，获得向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体；

(2)引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体

将步骤(1)中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体；

(3)构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体

采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；

(4)构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体

将步骤(3)中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体；

(5)标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化

将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内-80℃保存。

2.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游800bp～10kb DNA序列的任何载体。

3.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的筛选基因包括抗性基因或β-半乳糖苷酶基因。

4.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。

5.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含有的任何酶切位点。

6.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种：

(1)用数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体；

(2)腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体；

(3)条件复制型重组腺病毒载体；

(4)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体；

(5)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的非复制型的重组腺病毒载体。

7.按照权利要求1或2所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于：所说的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白Ⅶ或核心蛋白Ⅴ或核心蛋白Ⅹ。