[发明专利]腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法。

背景技术

腺病毒有三种核心蛋白，分别为pVII、pV和mu。这些核心蛋白与腺病毒基因组DNA结合，在腺病毒感染细胞后，核心蛋白会随着病毒基因组DNA进入细胞核。因此，如果对腺病毒的核心蛋白进行荧光蛋白的标记则可以观察到病毒感染细胞的整个过程。

由于腺病毒基因组DNA核心蛋白基因区域没有合适的限制性内切酶的位点，因此通过同源重组的方法对腺病毒核心蛋白进行成功的彻底的遗传标记非常困难。目前研究报道标记核心蛋白的方法是在不删除腺病毒基因组原有的核心蛋白基因的前提下，在腺病毒基因组E3区域插入CMV启动子启动的核心蛋白-荧光蛋白基因表达元件，通过这种方法研究获得了荧光标记核心蛋白的腺病毒。经过该方法标记的腺病毒基因组同时编码野生型核心蛋白和荧光标记的核心蛋白，这两种蛋白要竞争结合到腺病毒基因组DNA上，荧光标记后的核心蛋白由于分子量和蛋白体积变大，很难与野生型核心蛋白竞争，因此荧光蛋白标记的核心蛋白结合到病毒基因组DNA上的效率很低，这样得到病毒大部分是未经标记或部分标记的病毒颗粒。

发明内容

本发明所要解决技术问题在于克服上述荧光蛋白标记的核心蛋白结合到病毒基因组DNA上效率很低的缺点，提供一种能快速、腺病毒核心蛋白完全能够标记的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法。

解决上述技术问题采用的技术方案它是由下述步骤组成：

1、构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体

采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，pUC19质粒载体为市场上销售的商品，由英国NEB公司生产，获得的阳性克隆命名为pUG19M，采用聚合酶链式反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，获得向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体。

2、引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体

将步骤1中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体。

3、构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体

采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；

4、构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体

将步骤3中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体。

5、标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化

将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内-80℃保存。

本发明的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游800bp～10kb DNA序列的任何载体。

本发明的筛选基因包括抗性基因或β-半乳糖苷酶基因。

本发明的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。

本发明的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含有的任何酶切位点。

本发明的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种：

(1)用数均分子量为4000～8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体；

(2)腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体；

(3)条件复制型重组腺病毒载体；

(4)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体；

(5)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的非复制型的重组腺病毒载体；

本发明的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白Ⅶ或核心蛋白Ⅴ或核心蛋白Ⅹ。

本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法，该方法实现了对腺病毒核心蛋白真正意义的遗传水平上的荧光标记，这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心蛋白基因，因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白，可以获得的100％被荧光蛋白标记的病毒颗粒。

附图说明

图1是用于组装核心蛋白pVII上下游同源臂的穿梭质粒载体示意图。