[发明专利]用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的引物组及检测体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测肠道病毒的引物组、检测体系、检测方法及用途。

背景技术

人肠道病毒隶属于微小核糖核酸病毒科，主要包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组和B组、埃可病毒及一些新肠道病毒。肠道病毒在全世界分布比较广泛，其主要传染源为病人或无症状带毒者，可引起脊髓灰质炎、手足口病等一系列疾病。我国近几年由肠道病毒引起的无菌性脑炎、手足口病、急性出血性结膜炎和新生儿急性心肌炎等疫情时有发生。建立一套快速、简便、可靠的肠道病毒检测方法，对提高肠道病毒疫情的应急能力，保障人类生存健康，有着重要的意义。

肠道病毒的传统检测方法为细胞培养法，存在费时费力、对培养技术要求高、结果不稳定、根据细胞病变无法判断是哪种病毒等不足之处。PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸多优点，但PCR方法存在对检测设备要求高，结果判断不直观等问题，限制其在基层单位的应用。2000年，Notomi T等发明的LAMP技术针对靶基因(DNA或cDNA)的6个区域，设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在恒温(65℃左右)水浴中反应1小时，核酸序列可扩增到10⁹拷贝，反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断。该方法缩短了扩增时间，提高了扩增效率，并且具有更高的灵敏度、特异性，降低了仪器设备及检测条件的要求，被公认为具有较强实用性的分子检测技术。目前，LAMP技术已经成功应用于多种病毒的检测，如SARS冠状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等。

发明内容

本发明的目的是提供了一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的引物组；

本发明的第二个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的检测体系。

本发明的第三个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的方法。

本发明的第四个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的检测体系的用途。

本发明的技术方案概述如下：

用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的引物组，它由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成。

用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的检测体系，该体系由下述原料组成：

10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；

25mmol/L的Mg²⁺ 1μL-3μL；

5mol/L的Betaine 2μL-6μL；

10mmol/L的dNTP 3.5μL-5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；

8U/μL的Bst酶1μL；

加超纯水至总体积为20μL。

用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的方法，它包括下述步骤：

(1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA；(2)取5μL所述cDNA加入到20μL的用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的检测体系中，10000转/分钟，离心30秒；(3)加入20μL矿物油，于61℃恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1-1.5小时；(4)取出反应管，加入SYBR Green Ⅰ型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在肠道病毒，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在肠道病毒，所述用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒的检测体系由下述原料组成：

10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；

25mmol/L的Mg²⁺ 1μL-3μL；

5mol/L的Betaine 2μL-6μL；

10mmol/L的dNTP 3.5μL-5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；

10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；

100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；