[发明专利]一种量子点免疫荧光探针的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种量子点免疫荧光探针的制备方法，属于纳米材料学、生物分析化学、纳米生物医学领域。

背景技术

量子点(quantum dots，QDs)，又称半导体纳米晶，其半径小于或接近激子波尔半径，主要由II-Ⅵ族元素(如CdTe、CdSe)或III-V族元素(如GaAs、InP)构成。量子点因具有独特的光学与电学特性近年来引起了科学界的广泛关注，其在紫外-可见光范围内广泛而连续的吸收光谱，窄且对称的荧光发射光谱使之具有单激发、多发射的多色标记功能。量子点还具有光稳定性好、耐光漂白的独特性质，使其有望取代传统的有机荧光染料，获得在生物医学荧光标记领域的广泛应用。

量子点在生物医学标记领域的应用，通常先需要与生物素/亲和素、抗体、寡核苷酸等生物分子结合，形成生物荧光探针，再加入样品中结合欲标记的相应配体、抗原或者核酸。量子点与抗体的结合可通过静电吸附法直接与抗体结合，这种方法虽然简单易行，但结合不够可靠，pH、温度、离子强度等环境因素改变可使量子点-抗体复合物解偶联。直接在水相中制备的水溶性量子点在制备过程中在其表面引入了大量的氨基或者羧基，因此可以通过这些功能集团与抗体蛋白分子中的氨基或者羧基形成化学共价偶联，得到稳定的量子点-抗体荧光探针

发明内容

为拓展量子点在生物医学领域内应用，本发明提供了一种将水溶性羧基化量子点用于标记具有生物活性的抗体蛋白进而制备免疫荧光探针的方法，该方法可将羧基化量子点有效地与抗体蛋白连接，并很好地保持抗体的生物活性，可应用于基于抗原抗体特异性结合的生物标记分析领域，例如基于测量荧光强度的抗原/抗体定量分析、酶联免疫吸附分析、标记细胞中特定蛋白的胞内定位、研究核酸杂交等。

本发明的量子点免疫荧光探针是在羧基化量子点末端连接特异性的抗体，通常可连接一个或者一个以上抗体分子，数目可以通过控制量子点和抗体的比例进行调整。

其中羧基化量子点的核心为CdTe、CdSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnS中的任意一种，且为水相中直接制备的，以巯基丙酸或者其他含羧基的巯基化合物修饰的水溶性量子点。所用的抗体可以是针对一种蛋白或者某蛋白的一个结构域，或者一段多肽的单克隆抗体，也可以是针对来自不同物种蛋白的多克隆抗体。

一种量子点免疫荧光探针的制备方法，其特征在于采用如下步骤：

A)用浓度为0.2mol/L，pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液溶解1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺，配制成羧基活化剂，活化剂中1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺和N-羰基琥珀酸亚胺的浓度均为50mg/mL，将该活化剂按体积比1∶8加入至浓度为1mg/mL市售羧基化量子点中，在室温下轻微振荡使羧基活化形成活泼酯，经高速离心机分离使量子点沉降，弃去上清液；

B)往步骤A)的量子点沉淀中加入A)中使用的磷酸盐缓冲液，在涡旋振荡器上轻微振荡使量子点重新悬浮至A)加入活化剂后的体积，再高速离心机分离及重悬，照此重复2次，再次高速离心使量子点沉降；

C)加入浓度为1mg/mL的抗体溶液，轻微振荡使量子点在抗体溶液中重新悬浮至步骤A)中加入活化剂后的体积，并使抗体与羧基活化的量子点充分接触，发生共价偶联反应，在室温下放置1h，每隔20min轻微振荡一次，1h后经低速离心机分离使形成的量子点团块沉降，所得上清液即为量子点免疫荧光探针。

本发明是在近年来发展起来的水热法直接制备水溶性量子点技术的基础上，用巯基丙酸作为稳定剂修饰量子点表面，使之带有大量的羧基功能基团，利用EDC和NHS或者其中之一作为羧基与氨基的偶联剂，将抗体可靠地连接在量子点表面。该方法简单易行、安全可靠，无需特殊仪器试剂，在大多数生物、化学实验室均可完成，适合推广应用于生物医学标记分析领域。

附图说明

图1为为量子点免疫荧光探针的照片。

图2为量子点免疫荧光探针的TEM图像。

图3为量子点免疫荧光探针结合了ELISA板底部的抗原后的荧光显微镜照片。

具体实施方式

实施例1：