[发明专利]魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离方法

权利要求书

1.一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其步骤是：

A、标样选择：选取软腐病症状的魔芋组织，在发病扩展前沿病健交界处，切割0.5-1.5cm组织块；

B、组织消毒：将组织块用自来水冲洗，选用75％体积比酒精消毒60-90s，然后用无菌水冲洗2-4次，在放有吸水纸的托盘上用手术刀在无菌操作台上切成0.5×0.5cm的组织块，接到营养琼脂培养基上；

C、细菌的获得：将组织块周边长出的菌采用平板划线分离法进行分离，24-28℃培养箱中培养48-72h后观察，根据菌落形态、颜色细菌培养性状，挑选单菌落，然后将细菌纯培养保存；

D、软腐病病原菌的筛选：将获得的纯培养细菌接种到欧文氏菌具有特色的结晶紫聚果胶选择性培养基上，24-28℃培养箱中培养48-72h后观察，菌体凹陷生长的为软腐病病原菌；

E、采用点接法进行拮抗菌的初筛：将营养肉汤培养基过夜培养的浓度为1×10⁸cfu/ml的魔芋软腐病病原菌菌悬液0.1ml涂布于营养琼脂培养基平板上，然后在每个平板上用无菌牙签均匀接种四个从魔芋病建交接处分离到的非软腐病病原菌，每个接菌平板平行做三份，本步骤重复三次，30℃恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直径；

F、采用牛津杯法进行拮抗菌的复筛：将初筛的拮抗菌株在营养肉汤培养基中200r/min，30℃培养2d，发酵液6000g离心20min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，经营养琼脂培养基培养无菌落生成，为无菌滤液，取过夜培养的魔芋软腐病病原菌菌悬液：浓度为1×10⁸cfu/ml的0.1ml均匀涂于营养琼脂培养基上，在每个平板上摆放牛津杯，在每个牛津杯中加入0.2ml的供试拮抗菌无菌滤液，每个平板牛津杯加入拮抗菌无菌滤液的处理平行做三份，本步骤重复三次，30℃恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直径。

2.根据权利要求1所述的一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其特征在于：所述的培养基为：将搅碎器预加热，在1000ml煮沸的蒸馏水，将以下成分依次加入，用低速搅拌。10％质量比结晶紫的水溶液2.0ml、1mol/l氢氧化钠9.0ml、1％质量比配制的氯化钙9ml、琼胶4g、硝酸钠2g、随后将聚果胶酸钠18g加入，高速搅拌15s，分装三角瓶中于121℃灭菌15min后倒入培养皿，制成平板干燥后使用。

3.根据权利要求1所述的一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其特征在于：所述的营养琼脂培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、琼脂20g、蒸馏水1000ml，在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂，加热溶化后，调节pH值至7.0-7.2，分装，121℃灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其特征在于：所述的营养肉汤培养基为：牛肉膏3g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、蒸馏水1000ml，在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，加热溶化后，pH值7.0-7.2，分装，121℃灭菌20min。