[发明专利]魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，属于植物病害防治技术领域。本发明所述的魔芋软腐病病原菌是由软腐欧式杆菌(Pectobacterium Species)侵染引起。

背景技术

魔芋是单子叶多年生草本植物，主要分布在东南亚和非洲。魔芋球茎中富含的葡苷聚糖使其在食品、医药、化工和农业中具有广泛的应用。随着魔芋加工产业对原料需求日益旺盛，种植面积不断扩大，而软腐病的发生也越来越严重，已成为魔芋产业发展主要障碍。

目前，农业生产中对软腐病的防治主要有农业防治与化学防治。农业防治效果并不显著，同时可调控性较差。因此，化学防治是目前应用最为普遍和广泛的防治方法，但是化学药剂的毒副作用，往往带来环境污染和生态破坏。寻找新的防治途径和方法来解决软腐病的危害成为迫在眉睫的事。

生物防治在病害防治方面开辟了新天地，同时符合环境保护、绿色食品生产和农业可持续发展的方针。生物防治技术就是把自然状态下，病原微生物存在拮抗作用或竞争关系的极少量微生物，通过人工筛选培养、繁殖后，再用到作物上，增大拮抗菌的种群量。或是将拮抗菌中起作用的有效成分分离出来，以工业化大批量生产，作为农药使用，达到防治病害的目的。前者称微生物农药，后者为农药抗菌素。近几年，不少研究者开始尝试开发生物制剂来防治魔芋软腐病。如云南大学姬广海等人采用解淀粉芽孢杆菌C3及其发酵液制成针对魔芋软腐病的生物制剂(ZL200510048755)；取得了高于46.7％的防效及其一定的增产作用，但该方法由于存在制备技术要求高以及生物安全性有待考证，植株一旦感病一样很难控制等多方面原因，尚未得到广泛的应用。

关于魔芋软腐病菌生物防治的报道极少，仅周盈等从魔芋愈伤组织继代培养中出现的细菌中筛选到了一株能抑制魔芋软腐病病原菌生长的枯草芽孢杆菌。但植物各个生长阶段的内生菌数量和种类各有不同，且筛选高效和活性稳定的拮抗菌株是保证生物防治获得成功的先决条件。自然界中微生物种类及其丰富，如何快速有效的获得魔芋软腐病病原菌拮抗菌的报道尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法。利用一物降一物的自然规律，通过分离感染软腐病魔芋组织的细菌，缩小拮抗菌的筛选范围。本发明具有操作简便、方法易行、能快速有效的筛选出抗魔芋软腐病病原菌拮抗菌，同时为其他作物拮抗菌快速筛选提供了思路。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种魔芋软腐病病原菌拮抗菌快速分离的方法，其步骤是：

A、标样选择：选取具有典型软腐病症状的魔芋组织，在发病扩展前沿病健交界处，切割0.5-1.5cm组织块；

B、组织消毒：将组织块用自来水冲洗，选用75％(体积比)酒精消毒60-90s，然后用无菌水冲洗2-4次，在放有吸水纸的托盘上用手术刀在无菌操作台上切成0.5×0.5cm左右的组织块，接到营养琼脂培养基上；

C、细菌的获得：将组织块周边长出的菌采用平板划线分离法进行分离，24-28℃培养箱中培养48-72h后观察，根据菌落形态、颜色等细菌培养性状，挑选单菌落，然后将细菌纯培养保存；

D、软腐病病原菌的筛选：将获得的纯培养细菌接种到欧文氏菌具有特色的结晶紫聚果胶选择性培养基(CVP)上，24-28℃培养箱中培养48-72h后观察，菌体凹陷生长的为软腐病病原菌；

E、采用点接法进行拮抗菌的初筛：将营养肉汤培养基过夜培养的浓度为1×10⁸cfu/ml的魔芋软腐病病原菌菌悬液0.1ml涂布于营养琼脂培养基平板上，然后在每个平板上用无菌牙签均匀接种四个从魔芋软腐病病建交接处分离到的非软腐病病原菌，每个接菌平板平行做三份。本实验步骤重复三次。30℃恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直径；

F、采用牛津杯法进行拮抗菌的复筛：将初筛的拮抗菌株在营养肉汤培养基中200r/min，30℃培养2d，发酵液6000g离心20min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，经营养琼脂培养基培养无菌落生成，视为无菌滤液。取过夜培养的浓度为1×10⁸cfu/ml魔芋软腐病病原菌菌悬液0.1ml均匀涂于营养琼脂培养基上，在每个平板上摆放四个牛津杯，然后在每个牛津杯中加入0.2ml的供试拮抗菌无菌滤液。每个平板牛津杯加入拮抗菌无菌滤液的处理平行做三份，以上实验步骤重复三次。30℃恒温培养箱中培养24h后测定其抑菌圈直径。