[发明专利]一种表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法

权利要求书

1.一种表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法，其特征在于：该方法直接从新药研究的末端药物临床研究阶段的药物代谢动力学靶标入手筛选候选可能活性先导药物，构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬时转染HepG2细胞；通过在自发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤光虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同可能活性先导药物对MRP2启动子活性的影响，进行体外PXR诱导可能活性先导药物的高通量筛选。

2.根据权利要求1所述的表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法，其特征在于：所述构建含MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因及PXR的表达质粒，瞬时转染HepG2细胞的步骤如下：

步骤一：MRP2基因启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建，过程是：

(1)血样采集和DNA抽提；

采集健康志愿者外周静脉血5mL，置于EDTA抗凝的玻璃试管，贮存于-40℃冰箱备用；

(2)DNA抽提方法；

按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4℃冰箱备用；

(3)MRP2 promoter PCR；

(4)扩增产物回收；

(5)把MRP2的PCR产物连接在pGEM-T载体上，提取质粒，酶切和测序；

(6)将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和PGL4.17载体用内切酶双酶切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接；转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆抽提质粒，酶切和测序；

(7)重组克隆进一步培养扩增；

步骤二：PXR cDNA表达质粒的构建，过程是：

(1)RNA抽提和逆转录；

用Trzol从原代培养的肝细胞中提取总RNA，用RevertAid^TM First Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增；

(2)PXR PCR；

(3)把PXR的PCR产物连在pPEM-T载体上和测序；

(4)将测序证实插入片段无PCR错配的质粒DNA和pcDNA3.1/hisB(-)载体用HindⅢ和EcoRⅠ同时双酶切，用琼脂糖电泳分别回收插入片段及载体，使用凝胶块快速链接；转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆抽提质粒，酶切鉴定；

(5)重组克隆进一步培养扩增，抽提质粒DNA；质粒DNA保存在70％乙醇中保持无菌状态，-20℃冻存待用；

步骤三：MRP2报告基因质粒和PXR cDNA表达质粒的鉴定，过程是：

(1)MRP2和PXR分别双酶切；

(2)1％琼脂糖凝胶电泳；

(3)测序分析；

步骤四：用报告基因质粒，pRL-TK(内对照质粒)和pcDNA3.1/hisB(-)-PXR瞬时转染HepG2细胞，过程是：用质粒中量提取试剂盒纯化质粒DNA，把荧光报告基因质粒，pRL-TK，PXR和对照质粒根据Lipofectamine2000说明转染HepG2细胞；每次实验中均包含下列样品组，以另一报告基因载体pRL-TK作为内对照与PXR表达质粒和各待测的荧光报告基因载体进行共转染，通过测定其基因产物Renilla Luciferas的活性，校正各孔间的转染效率。

3.根据权利要求1或2所述的表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法，其特征在于：所述体外PXR诱导可能活性先导药物的高通量筛选步骤如下：

步骤一：培养HepG2细胞；

步骤二：HepG2细胞以每孔2×10⁵个细胞的密度用不含胎牛血清和抗生素的DMEM培养基接种于24孔培养板；每孔分别转入600ng MRP2报告基因质粒或对照质粒，100ngPXR质粒和10ng pRL-TK。用适量不含抗生素和胎牛血清的培养液分别稀释DNA和Lipofectamine2000脂质体后，将二者混合，室温放置20min，加入培养板孔中，轻轻晃动孔板使均匀；6h后，换新鲜含10％小牛血清的DMEM，加入DMSO、阳性药物和各种不同浓度的候选可能活性药物，孵育24h；

步骤三：孵育24h后，将生长培养基从待检细胞吸出；

步骤四：用1×PBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出；

步骤五：向细胞培养孔中加入适量1×被动裂解缓冲液(PLB)；

步骤六：报告基因的活性检测及分析；

报告基因活性检测的过程是：

(1)转染后孵育24h，将生长培养基从待检细胞吸出；

(2)用1×PBS漂洗细胞，不要接触贴壁细胞，尽可能多地将漂洗用PBS吸出；

(3)向细胞培养孔中加入适量1×被动裂解缓冲液(PLB)；

(4)检测荧光素酶活性：细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在在发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值分别反映不同药物对MRP2启动子活性的影响。