[发明专利]一种表达PXR-MRP2荧光报告基因技术平台高通量药物筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和药理学领域，具体地说，涉及一种在HepG2细胞内表达孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)及药物转运体—有机阴离子转运多肽(multidrug resistance-associated protein，MRP2)和海肾荧光素酶内参报告基因技术平台，利用该技术平台筛选能够通过激动PXR来对靶基因—药物转运体MRP2产生诱导的可能活性药物配体，用于新药筛选的方法。

背景技术

新药的研发是一个高投入、高风险，同时也是高收益的产业。在美国食品药品监督管理局FDA往往需要科研工作团队花上10几年的时间，数亿美元的支出才能使一种新药最终上市。期间在临床前的实验室研究阶段对可能活性药物的初步药效学及一般毒理学研究以及临床研究阶段的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期研究都有很多不确定因素，使得研发的新药大部分中途夭折，从而浪费了大量人力及物力成本。因此，对可能活性先导药物的高通量筛选以及有效甄别能否最终实现该药物的临床应用方法成为药学及医学工作者研究的热点。制约一个新药能否上市有三个最主要因素，即：是否“安全、有效、可控”。一个研发中的新药或者已经上市的药物，即使其疗效突出，质量可控，如果产生了严重不良反应都会被禁止研发和销售。因此，以新药临床研究阶段药物代谢动力学特征为靶标高通量筛选可能候选药物被医药界认为是新药高通量筛选研究的新领域。

多药耐药相关蛋白MRP2是表达在胆小管膜上的药物外排ATP结合盒式蛋白超家族转运体，是外来信号核受体PXR的靶基因。MRP2被认为与药物不良反应和不可预期的药物—药物相互作用药物代谢动力学特征相关。有证据证实ATP结合盒式蛋白超家族在临床药物处置过程中发挥着关键作用。特别是肝内特异性表达着大量的MRP2可以转运很多底物药物：抗癌类阿霉素、依托泊苷、米托蒽醌、顺铂、长春新碱、长春碱、喜树碱，HIV治疗药物类茚地那韦、拉米夫定、沙奎那韦、阿德福韦、西多福韦、奈非那韦，他汀类药物普伐他汀，内源性物质有胆汁酸、胆红素、白三烯、雌二醇、谷胱甘肽等。表达或功能底下的MRP2引起血浆中胆汁酸、胆红素及血浆结合他汀类药物增多，从而产生胆汁淤积及黄疸性疾病和药源性横纹肌溶解症。同时，PXR是通过与MRP2启动子区特异性序列结合来诱导其表达，而一些可能的活性先导药物恰恰是PXR的配体。因此，找到诱导PXR调节MRP2表达的可能活性先导药物，就可以有效治疗胆汁淤积、黄疸性疾病以及由于底物药物累积所引起的药源性不良反应疾病。运用可能的活性先导药物处理表达PXR和含有MRP2启动子区结合序列的海肾荧光素酶内参报告基因瞬时转染的HepG2细胞，就可以在自发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光与海肾荧光的比值反映不同的可能活性先导药物对MRP2药物转运体启动子活性的影响。最终实现运用荧光报告基因的方法高通量筛选对PXR有诱导作用调节MRP2表达的可能活性先导药物。这一筛选途径在最终寻找到有效治疗胆汁淤积、黄疸性疾病、药源性横纹肌溶解症新的活性药物方面具有重要意义。也可以规避一些其它药物筛选方法所得到的药物因最终临床用药过程产生的药物—药物相互作用所引起的严重毒性，并降低合并用药的药物不良反应。

有研究为了找到治疗氧化应激引起的心机损伤的药物，把在氧化应激引起的细胞凋亡通路中起着至关重要的p66^shc基因启动子片段克隆到荧光素酶报告基因的上游，获得了p66^shc基因启动子控制的荧光素酶报告基因表达质粒，并将其转染人的肺癌细胞A549，得到稳定转染细胞系A549/p66^shc。并利用报告基因筛选系统，筛选了数百种中药提取物及单体化合物，找到了2种中药提取物和8种单体化合物。

也有研究为了找到治疗心血管糖尿病的药物，建立了以类法尼醇X受体(Farnesoid X receptor，FXR)为靶点的FXR激动剂高通量筛选模型。就是从肝细胞扩增出FXR配体活化结合结构域(ligand bingding domain，LBD)基因序列，并构建了融合表达载体pBind-FXR和报告载体pG13-GAL4。通过表达质粒和报告质粒共转染，瞬时转染L102细胞，通过测定报告基因荧光素酶的表达，对880个真菌及放线菌的次生代谢产物和120个纯化样品进行了FXR的激动剂筛选，得到了CoQ10和F01WA2076A两个活性化合物。