[发明专利]一种保藏微藻藻种的方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域的微藻藻种保藏方法，特别是涉及一种可以长期保藏微藻藻种的方法。

背景技术

藻类是最低等的自养放氧植物，它是低等植物中种类繁多、分布极其广泛的一个类群。无论是海洋、淡水湖泊等水域，或是潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方都能生存。微藻则是指一些微观的单细胞、群体或丝状的藻类，大多数是浮游藻类，生物量大、分布广。藻类通过热解可获得生物质燃油，是重要的可再生生物能源；通过农业化学技术可从一些富含脂肪的微藻中提取油脂，用于制备食用油或生物柴油；藻类中还含有多种维生素、胡萝卜素、蛋白质、脂肪酸等成分，是药用活性物质的重要来源；藻类还可用于污水处理等。据估算，地球上的生物每年通过光合作用可固定8×10¹⁰吨碳，生产1.46×10¹¹吨生物质，其中40％应归功于藻类的光合作用。因此，藻类生物与人类的生存和发展有极其密切的关系，是重要的可再生生物资源。

微藻藻种的保藏技术一直是制约生产培养单位藻种正常供应和长期保存的重要因素。国内外关于微藻藻种保藏技术报道并不多，目前常用液体传代保藏法保藏藻种，这种方法保种时间短，在低温下仅能保藏3个月，营养盐消耗也快，易污染，工作量也大，容易造成保种的失败。王勇军等人在《水产养殖》2003年第24卷第1期《常用海洋单细胞藻种的固体培养基的保藏技术》一文中介绍了一种海洋微藻固体培养基保藏技术，这种保藏技术在5～8℃下保藏时间约为1年，若延长保存时间，则需要降低温度，但是过低的温度又会造成藻种的死亡，而且用固体培养基长期保藏会造成固体培养基表面干燥，所以也需要定期移种，造成污染和杂菌生长。项文钰等人在《水利渔业》2004(3)：23-24页《微藻冷冻保藏的研究》一文中采用液氮深冷保藏法对小球藻和蛋白核小球藻的保藏作了研究，采用甘油、DMSO作保护剂，此种技术虽然保藏效果较好，时间也较长，但是必须在液氮中深冷保藏，不利于运输。

根据上述分析，目前科研与生产中，微藻藻种可实现短期或中期保藏，但存在着保藏时间短、易染杂菌、不便于运输、复活过程繁琐等的缺陷。而长期有效保藏的方法较少，需要开发出理想的长期保藏藻种的方法，而且需要所保藏的藻种复活过程方便快捷。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种理想的长期保藏微藻藻种的方法，本发明方法具有能够避免杂菌污染、保存效果好、时间长、并且在常温下能够保存、便于运输以及可方便复活使用等诸多优点。

本发明微藻藻种保藏的方法包括以下内容：将所要保藏藻种收集，获得藻泥，使之与保护剂混合制成藻种细胞悬液，上述藻种细胞悬液经过程序预冻过程，最终完全冻结；冻结后的藻种细胞悬液在减压的条件下使水分升华，形成固形海绵体状物质保藏即可，此时藻种的生长和代谢都暂时停止，活性得到保留，可在室温下长期保存。

本发明方法中，所保藏的微藻藻种可以选自普通小球藻、葡萄藻、小环藻、微绿球藻、硅藻等单细胞藻类之任何一种。

本发明方法中，所收集的藻种培养液生长状态良好，最优选藻液处于生长的稳定期。

本发明方法中，制作藻种细胞悬液的保护剂为脱脂乳和维生素的复合保护剂，以重量计脱脂乳的含量为5％～20％，维生素为0.5％～2％，藻种细胞悬液的细胞密度为1.0×10⁸～5.0×10⁹个/mL。其中的维生素可以是维生素B、维生素C、维生素E中的一或几种，维生素B如B₂、B₁₂、等中的一种或几种，优选为维生素E。

本发明方法中，程序预冻过程采用逐步降温的方式对藻种细胞悬液进行预冻，优选进行三级预冻过程，室温～4℃维持4～6小时；4℃以下至-18℃维持4～6小时，-18℃以下至-60℃维持4～6小时。

本发明技术方案可以通过以下具体步骤得到进一步实现：

(1)将处于稳定生长期的藻液通过镜检，确定无杂菌后低温下(优选10℃以下)离心收集藻泥。

(2)将步骤(1)的藻泥加入配制的复合保护剂中，制成藻种细胞悬液，藻细胞密度大约为1.0×10⁸～5.0×10⁹个/mL。

(3)将(2)步骤的藻种细胞悬液分装在保存藻种用的安瓿管中，每个分装0.2mL，并用消毒过的脱脂棉把口封住，避免空气中的杂菌污染。

(4)将分装好藻种细胞悬液的安瓿管在冷冻设备中采取分级降温进行预冻。