[发明专利]应用AS-PCR检测牛白细胞粘附缺陷的方法

说明书

技术领域

本发明属于动物分子检测技术领域，具体涉及一种在体外检测牛白细胞粘附缺陷(BLAD)的方法。

背景技术

白细胞粘附缺陷(Bovine LeukocyteAdhesion Deficiency，简称BLAD)是一种可以影响牛免疫系统的常染色体隐性遗传缺陷，于1983年在美国牛群中首次发现(Hagemoser et al.，1983)。该遗传缺陷主要是由白细胞表面的一种叫做整合素的糖蛋白表达缺陷所致(Gerardi et al.，1996)，因为在炎症反应时，外周血液中的中性粒细胞会发生一系列反应，包括被趋化物质和炎性刺激物致敏、粘附到血管内皮上、穿过血管壁、在基质中向炎症部位趋化，最终到达病原侵入的部位，对病原体直接做出反应等，而其中最为关键的是中性粒细胞与血管内皮粘附分子相互作用而粘附到血管内皮上，这个过程必须由中性粒细胞表面的整合素糖蛋白分子介导才能发生(Springer et al.，1990；Nagahata et al.，1995)。当整合素的表达水平低于1％时，临床上会出现严重的感染，甚至会危及生命。整合素分子是由α亚基(CD11)和β亚基(CD18)以非共价键相连构成的异源二聚体；每个整合素分子都是由α亚单位和共同的β亚单位构成才能行使功能(Kishimoto et al.，1987；Springer et al.，1990)。Shuster et al.(1992)对患有BLAD的荷斯坦奶牛的CD18编码基因进行了序列分析发现了两个点突变，其中一个突变(A 383G)引起了该糖蛋白中位于胞外高度保守区的第128位氨基酸的改变，由天门冬氨酸变成了甘氨酸，致使白细胞表面的整合素表达明显减少或缺乏，从而引起临床发病。在临床上，发病个体的白细胞为正常个体的7-20倍，白细胞表面整合素表达减弱或者无表达(Nagahataet al.，1997)，BLAD患病个体还表现为不爱运动，生长发育受阻，肝、肾变性，脾大；反复的细菌感染广泛的卡他性支气管肺炎等，还可观察到多发性肺坏死灶，胃炎，口膜溃疡，严重的牙周炎，牙龈萎缩，坏死性喉炎，颌下软组织膨大、轻微腹泻等(Nagahata et al.，1995；Van Garderen et al.，1994)

我国荷斯坦种公牛主要从美国、加拿大、德国以及澳大利亚和新西兰等国进口，包括进口的活牛和胚胎。以前我国对该疾病没有足够的认识和重视，引入了大量潜在的BLAD携带者，同时引入的大量没有系谱资料的荷斯坦母牛，同样是潜在的携带者。这些引进的种公牛在我国的大量使用，使得我国的DUMPS携带者数目增加，由于没有自主产权的检测技术，因而无法公布母牛的检测结果，很难根据系谱推断DUMPS的传播途径。我国针对遗传性疾病展开的工作刚刚起步，在奶牛实际育种中开展的工作还不多，并且仅局限在实验室中(李艳华等，2008)，我们应该在生产实践中及时检测出冷冻精液及母牛中DUMPS的携带者并予以淘汰，以减少经济效益的损失。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻找一种简便有效的在体外检测牛白细胞粘附缺陷的方法。

实现本发明的技术路线如下所示：

本发明建立了一种快速、准确检测牛白细胞粘附缺陷的AS-PCR方法，其具体步骤如下：

(1)引物设计：根据GenBank提供的牛CD18序列(登录号：281877)，并根据AS-PCR的特性，利用生物学引物设计软件Premier 5，设计了AS-PCR扩增引物。该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该引物序列详见具体实施方式中的实施例1所示。

(2)等位基因特异性PCR(AS-PCR)：提取牛血样基因组DNA，根据PCR扩增可直接判断结果。若扩增的目的片段为818bp(见SEQ ID NO：2)，则为健康个体；若扩增出的目的片段为818bp和500bp(见序列表SEQ ID NO：2和3)，则为杂合子，即BLAD疾病携带者；若个体扩增出的目的片段为500bp(见SEQ ID NO：3)，则为致病纯合子。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：