[发明专利]一种细胞分选磁珠及合成方法以及其在细胞分选中的应用

权利要求书

1.一种用于细胞阴性分选的磁珠，其特征在于该磁珠为表面上以共价键偶联protein A，并通过protein A与IgG的Fc段的特异性相互作用，定向偶联IgG型小鼠CD3抗体的50-70nm的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄@Au纳米颗粒)。

2.如权利要求1所述的磁珠，其特征在于CD3抗体在该磁珠上的偶联方式为定向偶联，且偶联量为(55-65μgCD3抗体)/(mg磁珠)。

3.如权利要求1或2所述的用于细胞阴性分选的磁珠的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用共沉淀法制备15nm Fe₃O₄纳米颗粒；

(2)用羟胺还原HAuCl₄的方法，在前述Fe₃O₄纳米颗粒表面包裹一层金，制得50-70nm的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄@Au纳米颗粒)；

(3)用16-巯基十六酸将前述金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄@Au纳米颗粒)表面羧基化；

(4)将protein A以共价键偶联在前述被表面羧基化的颗粒上；

(5)使IgG型小鼠CD3抗体通过Fc段定向固定在前一步骤制得的偶联有protein A的磁珠上；

(6)将使用前述方法制得的磁珠上未反应的活性位点进行封闭。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述的步骤(1)为：将摩尔比为2∶1的FeCl₃·6H₂O和FeCl₂·4H₂O溶于40mmol/LHCl水溶液，制成铁盐水溶液，在机械搅拌下，将制得的铁盐溶液逐滴滴加至1.5mol/L NaOH水溶液中，前述过程中控制温度保持在80℃，将制得的Fe₃O₄磁性纳米颗粒用磁铁分离、收集后用纯净水洗涤4次，再将Fe₃O₄磁性纳米颗粒分散于纯净水中，制成0.1mol/L的Fe₃O₄储备液，本步骤中使用的Fe³⁺、Fe²⁺与NaOH之间的摩尔比为2∶1∶37.5；

所述的步骤(2)为：将前一步骤中制得的0.1mol/L的Fe₃O₄储备液与0.2mol/L的NH₂OH·HCl水溶液滴加至0.01mol/L TMAOH水溶液中，加热至80℃，在充分搅拌下，将0.1％(w/v)HAuCl₄水溶液滴加至上述溶液中，然后在2小时内缓慢滴加15mmol/L柠檬酸钠水溶液，滴加完成后继续加热搅拌3小时，该步骤中控制溶液温度保持在80℃；生成的金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄@Au纳米颗粒)经磁铁分离后，先后分别用纯净水和乙醇各洗涤2次，9,000rpm离心15分钟，弃去洗涤液，在真空干燥箱中60℃放置1-2小时烘干，得到金包裹Fe₃O₄磁性纳米颗粒(Fe₃O₄@Au纳米颗粒)，本步骤中使用的Fe₃O₄储备液、NH₂OH·HCl水溶液、HAuCl₄水溶液、柠檬酸钠水溶液之间的体积比为1∶0.3∶15∶8∶20，Fe₃O₄、NH₂OH·HCl、TMAOH、HAuCl₄和柠檬酸钠之间的摩尔比为5∶3∶7.5∶1.2∶15；

所述的步骤(3)为：按重量(mg)∶体积(ml)为5∶2的比例取Fe₃O₄@Au纳米颗粒超声分散于20mmol/L 16-巯基十六酸的乙醇溶液中，超声反应48h；反应完毕后将磁珠溶液用乙醇洗涤3次，9,000rpm离心15分钟后，再分散至乙醇中，制成2mg/mL羧基化的磁珠分散液；

所述的步骤(4)为，a.活化：取前述羧基化的磁珠分散液，磁铁分离后弃去乙醇，重新分散于含有EDC和NHS的、浓度分别为20mg/mL和10mg/mL的水溶液中，超声反应1小时，反应过程中每隔5分钟将反应液充分混匀一次，其中使用的磁珠分散液与含有EDC和NHS的水溶液两者体积比为1∶2，b.proteinA偶联：将活化后的磁珠用磁铁分离后重新分散于含有150μg/mL protein A的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时；

所述的步骤(5)为，将上一步骤获得的偶联有protein A的磁珠用磁铁分离后分散于含有100μg/mL小鼠CD3抗体的PBS溶液中，置于摇床上在4℃下以40rpm的速度混匀反应12-14小时，使CD3抗体通过Fc段定向固定在偶联有protein A的磁珠上。