[发明专利]一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

恩拉霉素(Enramycin)，又名安来霉素，是由土壤中分离出来的放线菌Streptomyces fungicidious NO.B5477发酵产生的一种多肽类抗生素。恩拉霉素因其强大的杀菌作用而被命名为Enduracidin，之后世界卫生组织(WHO)确定其通用名为恩拉霉素。恩拉霉素是一种有机碱，其盐酸盐为白色结晶性粉末，分子量约为2500，融点为238～245℃。本品易溶于稀盐酸和二甲亚砜，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于乙醇和丙酮，不溶于苯、氯仿等。恩拉霉素的化学结构可通过部分水解肽键的方法测定。现已证实，恩拉霉素是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成，其中氨基酸分子构成环状多肽结构，脂肪酸位于多肽结构末端。据其末端脂肪酸种类不同，得到A、B两种组分，即A(C₁₀₇H₁₃₈C₁₂N₂₆O₃₁)和B(C₁₀₈H₁₄₀C₁₂N₂₆O₃₁)。恩拉霉素则是由这两种组分组成的混合物。作为一种全新的多肽类抗生素饲料添加剂，恩拉霉素被世界上许多国家推荐使用。

目前，恩拉霉素生产通常采用传统的斜面培养，接种环挖块接种摇瓶，摇瓶再接种子罐的工艺，制种工艺繁琐，染菌几率高，发酵结果不稳定，重复性差。

发明内容

本发明针对上述生产恩拉霉素工艺的不足，提供了一种工艺简单、发酵产量高的微生物发酵生产恩拉霉素的方法。

本发明是通过以下措施来实现的：

以往生产恩拉霉素的方法是通过斜面培养和摇瓶培养制备菌种的，但是斜面培养保藏时间短、不稳定，需要循环不断的制作筛选高产斜面。本发明对传统的工艺进行了改进，优化了制种过程，通过液氮环境冻存的方法使制得的菌种可以长期保存，这样可以一次性制备大量的菌种，省去了繁琐的重复制种步骤，缩短了生产时间；且本工艺发酵结果稳定，重复性好，恩拉霉素产量大，可达8500μg/ml以上(HPLC)。

本发明所用的菌株为杀真菌素链霉菌(Streptomyces fungicidicus)SDSL1205，已于2010年6月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.3933。

该SDSL1205菌株是通过以下几个阶段选育出来的：

一、从野生菌Streptomyces fungicidicus SDSL1号菌出发，经连续紫外诱变得到比出发菌株产量提高203％的236号高产菌株。

二、将236号高产菌株经连续的链霉素抗性筛选，得到较236菌株产量提高191％的417菌株。

链霉素抗性筛选过程为：将链霉素按照30～200ug/ml的浓度添加至平板培养基中，制作成平板，121℃灭菌30分钟。利用该链霉素抗性筛选平板筛选抗链霉素的菌株，培养温度27～30℃，培养时间6～7天。平板培养基组分为：可溶性淀粉9-13g/L、酵母浸膏1.5-2.2g/L、琼脂18-20g/L，培养基pH6.8-7.0。

三、将417菌株经多轮亚硝基胍诱变，结合链霉素抗性筛选得到SDSL959菌株，较417菌株产量提高96％。

四、SDSL959菌株经多轮自然分纯，链霉素抗性筛选得到SDSL1205菌株，产量达到8500U/ml以上。

本发明的技术方案如下：

一种微生物发酵生产恩拉霉素的方法，包括以下步骤：

(1)制备冻存孢子液：

a.将杀真菌素链霉菌CGMCCNo.3933接种到多个平板培养基上进行扩大培养，得到大量杀真菌素链霉菌孢子；所得孢子具有灰色、圆形、中间有小突起特征；

b.将上述得到的孢子刮到甘油水溶液中，打散混匀制成孢子液，将孢子液分装在冻存管中在液氮环境中冷冻保存，待用；每毫升孢子液中含1.0×10⁸-1.0×10⁹个杀真菌素链霉菌孢子；

(2)种子培养：将冻存孢子液接种到种子培养基中，每30L培养基接种1-2ml冻存孢子液，培养得种子液，种子液中的固形物占种子液总量的20-30体积％；

(3)发酵培养：按4-6wt％的接种量将种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；