[发明专利]天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建方法

权利要求书

1.一种天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）健康人外周血淋巴细胞分离及总RNA提取，通过RT-PCR合成cDNA；

（2）以cDNA为模板，用一组几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）全部轻链可变区编码序列的特异性引物分别扩增人免疫球蛋白的轻链基因，得到几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）的完整κ和λ轻链基因；

（3）以cDNA为模板，用一组几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）全部重链可变区编码序列的特异性引物分别扩增人免疫球蛋白的Fd重链基因，得到几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）的γ重链Fd片段基因；

（4）将获得的人免疫球蛋白G（IgG）的轻链基因与噬菌体载体连接，构建轻链抗体库；

（5）将获得的人免疫球蛋白G（IgG）的Fd重链基因与轻链抗体库DNA连接，构建完整的人源IgG Fab噬菌体抗体库；

（6）经过多轮的抗原亲和吸附—洗脱—扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆，然后转化宿主使目标抗体表达；

（7）对纯化的抗体进行生物活性与功能鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述健康人的选择方法为近1～6个月未患有感染性疾病，年龄分布为20～40岁，人数为2～300名。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中，所述一组几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）全部轻链可变区编码序列的特异性引物如下所示：

扩增κ轻链基因的上游引物为：

VK1:   CCGCTAGCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC

VK2a:  CCGCTAGCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC

VK3a:  CCGCTAGCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCC

VK4:   CCGCTAGCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC

扩增κ轻链基因的下游引物为：

VKC: TTGGCGCGCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT

扩增λ轻链基因的上游引物为：

VL1a:  CCGCTAGCCAGTCTGYSCTGACTCAGCCW

VL1b:  CCGCTAGCCAGTCTGTGYTGACGCAGCCG

VL2a:  CCGCTAGCMACKTTATAYTGACTCAACCG

VL2b:  CCGCTAGCCAGACTGTGGTAACYCAGGAG

VL3a:  CCGCTAGCTCCTATGWGCTGACTCAGCCA

VL3b:  CCGCTAGCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC

扩增λ轻链基因的下游引物为：

VLC:   TTGGCGCGCCTGAAMATKCTGTAGSGGCCACTGT。