[发明专利]天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种天然人源IgGFab噬菌体抗体库的构建方法。

背景技术

基因工程抗体库技术是近年来发展起来的体外制备人源单克隆抗体的新方法，通过构建和筛选噬菌体抗体库，为科研和治疗用抗体的生产提供了一种新颖而有效的途径。噬菌体抗体库就是将抗体分子的多样性可变区基因组装到表达载体内，表达到噬菌体表面得到多样性噬菌体抗体的集合。通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，可极为有效的从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体的可变区基因。目前噬菌体抗体库主要应用于表达筛选Fab和单链抗体（single chain Fv，ScFv）。

ScFv可通过PCR直接将轻链和重链可变区基因组合在一起，减少一次重组过程，因此噬菌体单链抗体库构建操作较为简单。ScFv具有分子小，肿瘤穿透力高的优点，但也具有体内半衰期短、肿瘤摄取率低的缺点，是用于抗体靶向治疗的不利因素。此外，实验证明ScFv虽然具有良好的结合活性，但往往比亲本抗体的亲和力明显降低，同时其稳定性也较差。因而ScFv抗体的应用有一定的局限性。Fab是由重链Fd段和完整轻链组成，是完整抗体分子的三分之一，在体内的稳定性要远高于单链抗体，并且易于进行结构改造且细菌内表达产物多为有功能的抗体片段等优点，因此Fab在研究抗体可变区的功能活性以及临床应用有着不可比拟的优点。

目前构建Fab噬菌体抗体库的策略有两种。一种为应用双载体，分别构建轻链噬菌体抗体库和重链Fd段噬菌体抗体载体库，在表达Fab时，经过轻重链的重组配对，在同一个大肠杆菌内表达。该方法构建噬菌体抗体库虽然操作简单，但由于同一细胞内转入两个载体，要求转入的两个载体具有相容性。因此，这种策略构建的抗体库实际效率并不高。另一种方法为应用单载体，即将轻链基因和重链Fd段的基因重组在一个表达载体上，这样避免了双载体的相容性缺点，并可以大大提高抗体库多样性和库容量，在抗体库的实际应用中有着显着的优越性。

建立噬菌体抗体库的目的就是为了有效的获得针对各种抗原的人源抗体。天然噬菌体抗体库的抗体基因来自未经免疫的个体，理论上只要这种抗体库容量足够大、多样性好，就可以筛选到针对任何抗原分子甚至包括自身抗原的单抗。因而为了满足高通量筛选临床治疗用的低抗原性、高亲和性抗体，建具有高度多样性、通用性好、无抗原偏向性的大容量天然人源Ig Fab噬菌体抗体库有着极其重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提出一种构建高度多样性、无抗原偏向性的大容量天然人源IgFab噬菌体抗体库的方法，以用于高通量筛选临床治疗用的低抗原性、高亲和性人源抗体。

本发明提出的天然人源IgG Fab噬菌体抗体库的构建方法，包括如下步骤：

（1）健康人外周血淋巴细胞分离及总RNA提取，通过RT-PCR合成cDNA；

（2）以cDNA为模板，用一组几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）全部轻链可变区编码序列的特异性引物分别扩增人免疫球蛋白的轻链基因，得到几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）的完整κ和λ轻链基因；

（3）以cDNA为模板，用一组几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）全部重链可变区编码序列的特异性引物分别扩增人免疫球蛋白的Fd重链基因，得到几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）的γ重链Fd片段基因；

（4）将获得的人免疫球蛋白G（IgG）的轻链基因与噬菌体载体连接，构建轻链抗体库；

（5）将获得的人免疫球蛋白G（IgG）的Fd重链基因与轻链抗体库DNA连接，构建完整的人源IgG Fab噬菌体抗体库；

（6）经过多轮的抗原亲和吸附—洗脱—扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆，然后转化宿主使目标抗体表达；

（7）对纯化的抗体进行生物活性与功能鉴定。

在上述方法中，步骤（1）所分离及总RNA提取来源于2～300名健康人的外周血分离的淋巴细胞，健康人选择方法为：近1～6个月未患有感冒等感染性疾病，年龄分布为20～40岁。

在上述方法中，步骤（2）所述一组几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）全部轻链可变区编码序列的特异性引物，可以扩增得到几乎覆盖人免疫球蛋白G（IgG）的轻链基因。所述引物如下所示：

扩增κ轻链基因的上游引物为：

VK1:   CCGCTAGCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC  （SEQ ID NO.1）