[发明专利]牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法

权利要求书

1.牛肌卫星细胞的体外分离培养方法，其特征在于牛肌卫星细胞的体外分离培养方法按以下步骤实现：一、用D-Hanks液清洗牛肌肉组织并剪成1mm³的小块，然后置于含有0.25g胰酶的D-Hanks液中，在37℃下消化30min，再离心弃去上清，然后加入胶原酶液，在37℃下消化2～3h，得细胞悬液；二、采用400目孔径的筛网过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞，然后接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6；三、将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代，即完成牛肌卫星细胞的体外分离培养；其中步骤一中D-Hanks液由8g的NaCl、0.6g的Na₂HPO₄.2H₂O、4g的KCl、0.6g的KH₂PO₄、3.5g的NaHCO₃、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成；步骤一中胶原酶液由0.2g的胶原酶Ⅰ、100ml的DMEM高糖培养液和1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成；步骤二中细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的马血清、1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成，pH值为7.2；步骤三中传代的比例为1∶1。

2.根据权利要求1所述的牛肌卫星细胞的体外分离培养方法，其特征在于步骤一中加入胶原酶液，在37℃下消化2.5h，得细胞悬液。

3.诱导分化权利要求1所述方法培养的牛肌卫星细胞，其特征在于牛肌卫星细胞的诱导分化方法按以下步骤实现：一、采用100μl的DMEM高糖培养液对4μg的pEGFP-IRES-Myf6质粒和8μl的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PEI-质粒复合物；二、取体外分离培养的牛肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗牛肌卫星细胞两次，然后补加1.8ml的DMEM高糖培养液，再将PEI-质粒复合物逐滴滴加到牛肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A培养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温度为37℃并装有5%CO₂的培养箱中诱导分化48～72h，即完成牛肌卫星细胞的诱导分化；步骤二中细胞生长培养液A由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的马血清、1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成，pH值为7.2；步骤二中细胞生长培养液B由98ml的DMEM高糖培养液、2ml的马血清组成，pH值为7.2。

4.根据权利要求3所述的牛肌卫星细胞的诱导分化方法，其特征在于在温度为37℃并装有5%CO₂的培养箱中诱导分化50～70h。

5.根据权利要求3所述的牛肌卫星细胞的诱导分化方法，其特征在于在温度为37℃并装有5%CO₂的培养箱中诱导分化60h。