[发明专利]牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞的体外分离培养及诱导分化的方法。

背景技术

骨骼肌组织中的成肌细胞是以肌卫星细胞(satellitecell，SC)的形式而存在；实验表明骨胳肌中的肌卫星细胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦称之为“肌肉干细胞”，这种细胞是向成肌细胞系定向的一种前体细胞；肌肉再生过程主要是由肌卫星细胞来完成的；肌卫星细胞位于肌纤维的肌膜与基底膜之间，一般为小梭形扁平的单核细胞；当肌肉组织受到刺激时如骨骼肌受损时，卫星细胞就会被激活，大量分裂、增殖并相互融合形成再生肌纤维；激活的卫星细胞与受损伤细胞融合以修复受损伤细胞，或几个成肌细胞融合形成肌管，进而生成新的肌细胞。卫星细胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌细胞肥大、数目增多以及肌纤维转化的重要机制。肌卫星细胞体外分离培养成为研究肌肉分化途径及性状改良的分子机制的重要技术平台，为改良家畜肌肉品质及畜牧业生产领域奠定研究基础。

肌细胞是肌组织的前体细胞，易培养、可塑性强，具有骨骼肌的许多重要生物特性，对于肌卫星细胞的研究成为生物组织工程中的一个热门领域。不同年龄、不同肌肉类型中卫星细胞的数目不同，因此取材对于肌卫星细胞的原代培养很重要；一般来说，年幼个体的卫星细胞含量较丰富。  

目前，牛肌卫星细胞的分离培养一般均选用胶原酶Ⅺ和分散酶结合的方法，但是这两种酶的价格较高，导致牛肌卫星细胞的体外分离培养成本较高；且采用现有技术分离培养的牛肌卫星细胞传代稳定性不好，仅为1～10代。肌卫星细胞诱导分化为肌肉细胞的方法为采用DMEM高糖培养液+2%马血清的作用细胞，诱导分化细胞分化为肌管，以研究肌肉分化机理，对于原代培养的肌卫星细胞，用此种方法进行诱导分化，其分化后获得的肌管数量少，且无法获得具有收缩功能的肌管。

发明内容

本发明目的是为了解决现有牛肌卫星细胞的分离培养存在成本高，传代稳定性不好，且诱导分化存在所获肌管数量少及不具有收缩功能的问题，而提供牛肌卫星细胞的体外分离培养及诱导分化的方法。

牛肌卫星细胞的体外分离培养方法按以下步骤实现：一、用D-Hanks液清洗牛肌肉组织并剪成1mm³的小块，然后置于含有0.25g胰酶的D-Hanks液中，在37℃下消化30min，再离心弃去上清，然后加入胶原酶液，在37℃下消化2～3h，得细胞悬液；二、采用400目孔径的筛网过滤细胞悬液，然后离心，所得细胞沉淀用D-Hanks液重悬并离心，再用细胞生长培养液重悬细胞，然后接种于以多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶中，采用差速贴壁法培养细胞ppl至pp6；三、将pp6中的细胞培养至汇合率为95%，然后采用质量浓度为0.25%的胰酶进行传代，即完成牛肌卫星细胞的体外分离培养；其中步骤一中D-Hanks液由8g的NaCl、0.6g的Na₂HPO₄.2H₂O、4g的KCl、0.6g的KH₂PO₄、3.5g的NaHCO₃、5g的青链霉素、1.0g的两性霉素B和1000mL三蒸水组成；步骤一中胶原酶液由0.2g的胶原酶Ⅰ、100ml的DMEM高糖培养液和1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成；步骤二中细胞生长培养液由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的马血清、1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成，pH值为7.2；步骤三中传代的比例为1∶1。

牛肌卫星细胞的诱导分化方法按以下步骤实现：一、采用100μl的DMEM高糖培养液对4μg的pEGFP-IRES-Myf6质粒和8μl的PEI转染试剂分别进行孵育5min，然后混合并孵育15min，得PEI-质粒复合物；二、取体外分离培养的牛肌卫星细胞并培养至汇合率为75%，弃掉培养液，用DMEM高糖培养液清洗牛肌卫星细胞两次，然后补加1.8ml的DMEM高糖培养液，再将PEI-质粒复合物逐滴滴加到牛肌卫星细胞表面并作用4h，然后更换为细胞生长培养液A培养24h，再更换为细胞生长培养液B，在温度为37℃并装有5%CO₂的培养箱中诱导分化48～72h，即完成牛肌卫星细胞的诱导分化；步骤二中细胞生长培养液A由70ml的DMEM高糖培养基、20ml的FBS、10ml的马血清、1g的青链霉素和1g的两性霉素B组成，pH值为7.2；步骤二中细胞生长培养液B由98ml的DMEM高糖培养液、2ml的马血清组成，pH值为7.2。