[发明专利]一种用于特异性检测新型H1N1流感病毒的合成多肽

权利要求书

1.一种用于快速检测新型H1N1流感病毒的特异性合成多肽，其特征在于，所述特异性合成多肽的序列为：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

2.一种权利要求1所述特异性合成多肽的筛选方法，其特征在于，具体如下：

(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用已知DNA-STAR进行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；

(2)将筛选出的候选肽段与载体蛋白偶联，获得免疫抗体，通过特异性抗体的筛选，最终得到对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，该多肽的位点为322-340，其序列为：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。

4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：

以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1∶100000，进行终放血，收获血清；

利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛选，其中，

包被液：称取Na₂CO₃0.15g，NaHCO₃0.293g，蒸馏水稀释至100ml，得到0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存；

洗涤液(稀释液)：称取NaCl 8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸馏水加至1000ml，即为0.01mol/L pH7.4PBS-Tween-20洗涤液，4℃，保存；

封闭液：5％脱脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；

终止液：2mol/L的硫酸溶液；

然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，即：

1)包被抗原：用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜(12h以上)；

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

3)加封闭液200ul，37℃放置1h；

4)洗涤同2)；

5)加抗体：兔免疫血清用封闭液1∶500倍稀释，反应板每孔加100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；

6)洗涤同2)；

7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀释)，反应板每孔100ul，37℃放置1h；

8)洗涤同2)；

9)加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；

10)加终止液：反应板每孔50ul；

11)观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。