[发明专利]一种用于特异性检测新型H1N1流感病毒的合成多肽

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于特异性检测新型H1N1流感病毒的合成多肽。

背景技术

流行性感冒病毒简称流感病毒，是一类具有高度传染性的呼吸道病毒，也是被列入生物恐怖武器的其中一种。目前检测新型H1N1流感病毒的方法主要有病毒分离培养、逆转录多聚酶联反应(RT-PCR)、血清学诊断和抗原检测。但是，流感病毒分离鉴定所需的时间长、成本高，且需要在生物安全实验室或国家指定研究机构进行，而RT-PCR则依赖于特定的设备、良好的实验室条件和高素质的技术人员，难以在边境口岸推广应用，因此，亟待研究建立一种新型H1N1流感病毒快速、有效的抗原诊断技术。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于特异性检测新型H1N1流感病毒的合成多肽。

为实现上述目的，本发明特异性合成多肽序列为：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

上述特异性合成多肽的筛选方法为：

(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用DNA-STAR进行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；

(2)将筛选出的候选肽段与载体蛋白偶联，获得免疫抗体，通过特异性抗体的筛选，最终得到对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，该多肽的位点为322-340，其序列为：CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。

进一步，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。

上述步骤(2)具体为：

以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1∶100000，进行终放血，收获血清；

利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛选，其中，

包被液：称取Na₂CO₃0.15g，NaHCO₃0.293g，蒸馏水稀释至100ml，得到0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存；

洗涤液(稀释液)：称取NaCl 8g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，量取Tween-20，0.5ml，用蒸馏水加至1000ml，即为0.01mol/L pH7.4PBS-Tween-20洗涤液，4℃，保存；

封闭液：5％脱脂奶粉或BSA的pH7.4PBS；

终止液：2mol/L的硫酸溶液；

然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型H1N1流感病毒具有特异性的合成多肽，即：

1)包被抗原：用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱保存至少12h；

2)洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

3)加封闭液200ul，37℃放置1h；

4)洗涤同2)；

5)加抗体：兔免疫血清用封闭液1∶500倍稀释，反应板每孔加100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；

6)洗涤同2)；

7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(1∶1000倍稀释)，反应板每孔100ul，37℃放置1h；

8)洗涤同2)；

9)加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；

10)加终止液：反应板每孔50ul；

11)观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

本发明特异性合成多肽具有抗原制备简单，不存在生物安全问题，且比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，检测抗体的假阴性率和本底反应都很低等优点，综合流感病毒的诊断方法情况，以及当前全球防控流感的严峻形势，本发明无疑具有较大的市场价值和社会效益。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明。

本发明特异性合成多肽的筛选方法包括如下步骤：

(1)肽抗原表位的生物信息学选择与合成、修饰