[发明专利]韭葱黄条病毒检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.韭葱黄条病毒检测试剂盒，其特征在于韭葱黄条病毒检测试剂盒由20μL、浓度为10μmol/L的Oligo dT_（18）、40μL浓度为10mmol/L的d NTPs、20μL浓度为200mmol/L的DTT、20μL逆转录酶、10μL浓度为40u/μL RNase抑制剂、40μL10× M-MLV Reaction Buffer、10μL Taq DNA Polymerase、200μL10×Taq Buffer、200μL 浓度为25mmol/LMgCl₂、20μL浓度为10μmol/Lβ-actin上游引物和20μL浓度为10μmol/Lβ-actin下游引物组成；其中β-actin上游引物序列为5′-CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3′，β-actin下游引物序列为5′-CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3′。

2.韭葱黄条病毒检测方法，其特征在于韭葱黄条病毒检测方法按照以下步骤进行：一、向PCR管中依次加入2~5μg待测样品的RNA、1μL浓度为10μmol/L的Oligo dT_（18）、1μL浓度为10mmol/L的d NTPs，而后加入DEPC-H₂O 补足至总体积为15.5 μL， 在65℃条件下保温5min，然后冰浴5min；二、向步骤二反应后的产物中依次加入0.5 μL浓度为40u/μL RNase抑制剂、2μL10×AMVReaction Buffer、1μL浓度为200mmol/L的DTT、1μL逆转录酶混匀后，在2000rpm的条件下离心20s，然后在42℃条件下保温1 h后在 70℃条件下保温15min得到cDNA模板；三、向离心管中依次加入35.5μL灭菌双蒸水、5μL10×Taq Buffer、1μL浓度为10mmol/L的d NTPs、1μL浓度为10μmol/Lβ-actin上游引物、1μL浓度为10μmol/Lβ-actin下游引物、2μLcDNA模板、0.5μL Taq DNA Polymerase和4  μL MgCl2混匀，在2000rpm条件下离心20s后进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，45～65℃退火45s，72℃延伸1 min，共25～35个循环，72℃延伸10 min，4℃保温；四、PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳检测，即实现了的检测；步骤三中的β-actin上游引物序列为5′-CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3′，β-actin下游引物序列为5′-CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3′。