[发明专利]韭葱黄条病毒检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

韭葱黄条病毒（Leek yellow stripe virus，LYSV）是马铃薯Y病毒属Potyvirus的典型成员，是侵染大蒜的主要病毒。LYSV由蚜虫以非持久方式传播，广泛分布于世界各大蒜种植区，严重影响大蒜的产量和品质。由于大蒜为无性繁殖作物，随着种植年限的增加病毒病危害愈加严重，给大蒜产业的发展造成了严重影响。目前最有效的防治方法是大蒜脱毒苗的使用，而病毒检测技术贯穿始终。

目前，大蒜病毒病的检测技术主要有生物学检测、血清学检测和分子生物学检测。由于大蒜病毒往往都是复合侵染大蒜，具有相似的特征，试验寄主范围较重叠，并且在感病寄主上表现相似的症状，所以，很难通过生物学方法对大蒜病毒进行分离与鉴定。血清学方法仍是鉴定大蒜病毒的常用方法，但已有研究表明，同一属内不同病毒间CP基因氨基酸序列同源性较高，抗血清常常会产生交叉反应，从而造成假阳性的出现，不能将这些病毒有效的区分开；而且当病毒含量比较低的时候血清学方法很难检测到病毒。分子检测技术是发展趋势，尤其是RT-PCR分子检测技术给大蒜病毒的早期诊断提供了更加快捷、准确的检测手段。目前，我国已有关于LYSV的RT-PCR分子检测体系的建立，但还没有用于LYSV检测的两步RT-PCR检测试剂盒的研制。一旦需要时，主要从国外进口，由于价格昂贵，又不能及时供应，所以在国内推广有一定的困难。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有大蒜病毒病的检测方法存在的检测结果不准确以及检测成本高的问题，而提供了韭葱黄条病毒检测试剂盒及其检测方法。

本发明韭葱黄条病毒检测试剂盒由20μL浓度为10μmol/L的Oligo dT_（18）、40μL浓度为10mmol/L的d NTPs、20μL浓度为200mmol/L的DTT、20μL逆转录酶(AMV）、10μL浓度为40u/μL RNase抑制剂、40μL10× M-MLV Reaction Buffer、10μL Taq DNA Polymerase、200μL10×Taq Buffer、200μL 浓度为25mmol/LMgCl₂、20μL浓度为10μmol/Lβ-actin上游引物和20μL浓度为10μmol/Lβ-actin下游引物组成；其中β-actin上游引物序列为5′-CCGAATTCATGTTTGAGTATCAAGCCGG-3′，β-actin下游引物序列为5′-CCGTCGACTCACTGCATATGCGCACCAT-3′。

本发明韭葱黄条病毒检测方法按照以下步骤进行：一、向PCR管中依次加入2~5μg待测样品的RNA、1μL浓度为10μmol/L的Oligo dT_（18）、1μL浓度为10mmol/L的d NTPs，而后加入DEPC-H₂O 补足至总体积为15.5 μL， 在65℃条件下保温5min，然后冰浴5min；二、向步骤二反应后的产物中依次加入0.5 μL浓度为40u/μL RNase抑制剂、2μL10×AMVReaction Buffer、1μL浓度为200mmol/L的DTT、1μL逆转录酶（AMV）混匀后，在2000rpm的条件下离心20s，然后在42℃条件下保温1 h后在 70℃条件下保温15min得到cDNA模板；三、向离心管中依次加入35.5μL灭菌双蒸水、5μL10×Taq Buffer、1μL浓度为10mmol/L的dNTPs、1μL浓度为10μmol/Lβ-actin上游引物、1μL浓度为10μmol/Lβ-actin下游引物、2μLcDNA模板、0.5μL Taq DNA Polymerase和4  μL MgCl2混匀，在2000rpm条件下离心20s后进行PCR扩增，PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，45～65℃退火45s，72℃延伸1 min，共25～35个循环，72℃延伸10 min，4℃保温；四、PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳检测，即实现了韭葱黄条病毒的检测。