[发明专利]检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法

权利要求书

1.一种检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测R111X、IVS-4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个热点突变位点的七组引物中的至少一组；

第一组：所述检测R111X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物R111X M：

5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCAA-3’；

正常模板配对引物R111X N：

5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCGA-3’；

共同上游或下游引物R111X C：

5’-TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3’；

其中，所述突变模板配对引物R111X M和正常模板配对引物R111X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；

第二组：所述检测IVS-4-1热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物IVS-4-1 M：

5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAAC-3’；

正常模板配对引物IVS-4-1 N：

5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAGC-3’；

共同上游或下游引物IVS-4-1 C：

5’-TTCCATCCTCAACTGGATGA-3’；

其中，所述突变模板配对引物IVS-4-1 M和正常模板配对引物IVS-4-1 N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；

第三组：所述检测Y204C热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物Y204C M：

5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTGA-3’；

正常模板配对引物Y204C N：

5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTAA-3’；

共同上游或下游引物Y204C C：

5’-CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’；

其中，所述突变模板配对引物Y204C M和正常模板配对引物Y204C N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；

第四组：所述检测R243Q热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物R243Q M：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCAT-3’；

正常模板配对引物R243Q N：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCGT-3’；

共同上游或下游引物R243Q C：5’-TGTGGACCAGCCAGCAATGAACC-CAAACCTCATTCTTGCAGCAGG-3’；

其中，所述突变模板配对引物R243Q M和正常模板配对引物R243Q N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；

第五组：所述检测W326X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物W326X M：

5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTAC-3’；

正常模板配对引物W326X N：

5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTGC-3’；

共同上游或下游引物W326X C：

5’-GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’；

其中，所述突变模板配对引物W326X M和正常模板配对引物W326X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；

第六组：所述检测Y356X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物Y356X M：

5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCATA-3’；

正常模板配对引物Y356X N：

5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCAGA-3’；

共同上游或下游引物Y356X C：

5’-CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3’；

其中，所述突变模板配对引物Y356X M和正常模板配对引物Y356X N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；

第七组：所述检测R413P热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：

突变模板配对引物R413P M：

5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCCG-3’；

正常模板配对引物R413P N：

5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCGG-3’；

共同上游或下游引物R413P C：

5’-AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3’；

其中，所述突变模板配对引物R413P M和正常模板配对引物R413P N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。

2.一种采用权利要求1所述的试剂盒检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的PCR扩增方法，其特征在于：

(1)针对不同突变位点的检测，PCR扩增采用权利要求书1所列的七组引物中的至少一组；

(2)PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成，循环条件为

预变性：温度为94℃～98℃；

变性：温度为94℃～98℃；

退火：温度为55℃～65℃；

延伸：温度为68℃～72℃。