[发明专利]检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，该检测结果可用于临床辅助诊断苯丙酮尿症，属于生物医学领域中的临床检测技术。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)由阿斯布乔恩·佛伦(Asbjorn·Folling)于1934年首次发现，他用经典的有机化学分析方法发现患者尿液里含有大量的苯丙酮酸，苯丙酮尿症因此得名。PKU是一种由于氨基酸代谢缺陷而引起的一种常染色体隐性遗传病，发病率约为1/10000，杂合体频率约为1/50，是我国法定的新生儿期进行普查的两种疾病之一(另外一种是甲状腺功能低下)。

本病患儿出生时临床表现正常，但如果未经过法定的筛查及低苯丙氨酸饮食治疗的话，患儿一两个月后便开始出现异常症状。如皮肤、毛发和膜的色素减退，皮肤色白，头发呈褐色，约1/3婴儿出现湿疹，也有出现干燥和粗糙的皮肤异常；易流涎和出汗，汗液有特殊的霉臭或鼠样气味；约1/4的患儿出现痉挛性癫痫，加上轻癫痫发生率可达50％以上；大部分患儿表现行为焦躁，肌张力和运动过度，膝、股部屈曲，走路无节制；绝大部分患儿严重智力低下，头小畸形。

其发病机理在于人体必需的氨基酸苯丙氨酸被吸收后，一部分被利用合成蛋白质，一部分则通过酪氨酸途径降解，此过程需要苯丙氨酸羟化酶及其辅酶四氢生物蝶啶BH4的作用。当此二者中任何一种缺乏时，降解反应便不能进行。经典型苯丙酮尿症是指由于编码苯丙氨酸羟化酶(PAH)的PAH基因发生突变，导致苯丙氨酸羟化酶缺陷，而不能使苯丙氨酸转化为酪氨酸，苯丙氨酸在血液中堆积，并在转氨酶的作用下形成苯丙酮酸、苯乳酸、苯乙酸等旁路代谢产物；这些产物一部分随尿液排出，使尿呈特殊的霉烂臭味，而更多的产物则积聚在血液和脑脊液中，这对正在迅速发育的婴儿神经系统造成不同程度的毒害，引起不可逆的大脑损伤和严重的智力发育障碍。

临床上，在婴儿出生经母乳喂养3天后，通过足跟采血并检测新生儿血液中苯丙氨酸的浓度以达到PKU筛查的目的。一旦确诊，目前唯一的治疗方法是保持低苯丙氨酸的摄入量，具体措施是患者长期食用人工合成的含低苯丙氨酸的奶粉及其他食品。然而，这类食品不易获得而且价格昂贵，长期食用给患者的家庭带来沉重的经济负担。因此，对高危胎儿进行产前诊断，防止患儿的出生才是有效的解决方法。

人类PAH基因定位于12号染色体长臂，即：12q22-12q24.2，全长约90kb，其中包含13个外显子的长度在57-892bp之间，全长2.3kb，其阅读框架为1353bp共编码451个氨基酸。通过对PAH基因正常及突变序列的分析，绝大部分PAH缺乏或活性降低的病因在于PAH基因的点突变，而不是由于PAH基因的全部或部分缺失。突变或导致相应的氨基酸置换，而使PAH的理化性质改变，形成不稳定的酶蛋白或影响PAH酶的催化活性或者产生终止密码使PAH的合成提前终止，最终导致PAH缺乏；而剪接位点突变导致剪接异常，表达出错误的mRNA，进而翻译成异常的肽链，最终影响PAH酶的活性。

由于PCR技术以及DNA测序等分子生物学技术的广泛应用，导致经典型苯丙酮尿症的一系列PAH基因突变位点已经被发现。在PAH基因突变数据库已登记的320余种PAH突变中，近3/4的已知突变位于外显子5至外显子12之间，外显子7中的突变约占1/4。在国内，据研究和分析表明PKU基因突变已达25种，3/4的导致中国人经典型PKU的基因突变已经被查清，他们分别属于近20种不同的突变类型，而常见的有7种，具体见下表：

表1.中国人群PAH基因的7个热点突变位点

表1所列的7种突变类型的总数可达中国人PKU病例的70％左右。虽然建立利用内含子3内的STR(短串联重复序列)遗传标记进行连锁分析，判断高危胎儿携带的基因型来开展产前诊断的工作已有报道，但由于其技术本身的局限性，目前直接检测PAH基因中的点突变仍然是对PKU进行基因诊断和产前诊断的主要途径。目前，世界上有许多科研机构和生物科技公司正致力于基因突变检测的研究，已开发了许多有效的检测方法，如PCR-SSCP、TGGE、DGGE、SNaPshot、HRMA、分子信标、DNA直接测序等，然而这些方法的缺点是耗时多、花费大、效率较低，难以广泛推广应用。