[发明专利]大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)为十字花科芸薹属植物，是我国和东亚国家的重要蔬菜。品种的差异直接影响着大白菜的生产和食用品质，因此大白菜品种鉴别和纯度鉴定工作非常重要。传统的最可靠的种子纯度检测方法是GOT(grow-out test)法，它是通过田间种植，根据形态学特征对杂交种进行鉴定。GOT法的最大缺点是费时费力、容易受环境和主观因素的影响。近年来，同工酶、蛋白质电泳法可以用于蔬菜种子纯度的鉴定，然而，一些亲缘关系近、来自同一地区的蔬菜品种由于蛋白质电泳的多态性少，往往难以区分。因此，建立一套快速、精确、廉价的蔬菜种子纯度检测技术，显得非常必要。

随着现代分子生物学的发展，分子标记越来越多的被应用于种子纯度鉴定中，如以分子杂交为基础的RFLP、以酶切和PCR为基础的AFLP等、以PCR反应为基础的RAPD、SCAR、SSR、ISSR等。与其它分子标记相比，SSR标记具有许多独特的优点。SSR标记在单个座位上能检测到的多态性远高于其它几种分子标记，而且它广泛、随机地分布于整个基因组，具有共显性遗传的特点；SSR标记可以准确高效地鉴别大量等位基因；利用杂交种双亲在一些SSR位点的差异，可以将呈父母本互补带型的杂交种与其双亲、甚至也可以将一些异源花粉造成的杂交种区分开。由于上述特点，SSR标记逐步成为蔬菜作物品种鉴定的理想分子标记之一。

迄今为止简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)标记已在多种农作物种子的品种纯度鉴定中得到应用。根据建立SSR标记序列性质不同，SSR标记可分为，基因组SSR(gSSR)和表达序列标签SSR(EST-SSR)。与构建小片段基因组文库进行SSR的筛选建立gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST-SSR标记要经济得多；而且EST-SSR标记来源于DNA的转录区域，比gSSR标记具有更高的通用性。李新海等利用SSR标记研究了70份我国主要玉米自交系的遗传变异(参见《中国农业科学》，2003年第36卷第6期，《利用SSR标记划分70份我国玉米自交系的杂种优势群》)；番兴明等利用SSR标记将我国温带玉米主要杂种优势群进行了划分(参见《作物学报》，2003年11月，第29卷第6期，《利用SSR标记对29个热带和温带玉米自交系进行杂种优势群的划分》)；李稳香等用SSR标记对10个杂交水稻组合的子一代种子纯度进行了鉴定(参见《福建农林大学》，2006年，利用SSR标记构建水稻特征指纹及种子纯度分析的研究)；彭锁堂等对我国9个主要的杂交水稻组合及其亲本进行了SSR标记分析(参见《中国水稻科学》，2003年01期，我国主要杂交水稻组合及其亲本SSR标记和纯度鉴定)。陈琛等开发了甘蓝的EST-SSR标记(参见《园艺学报》，2010年02期，甘蓝EST-SSR标记的开发与应用)。李丽和郑晓鹰建立了用于白菜和大白菜品种鉴定的由3个引物对组成的6套EST-SSR复合标记组合(参见《园艺学报》，2009年11期，用于白菜和大白菜品种鉴定的EST-SSR复合标记的建立)。但是有关大白菜EST-SSR引物的开发远未达到饱和。为了提高EST-SSR标记的密度和提高大白菜品种鉴定的效果，有必要开发更多的EST-SSR标记。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供大白菜EST-SSR标记引物及其在品种鉴定中的应用。

大白菜EST-SSR标记引物BRE28，它由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物组成。

大白菜EST-SSR标记引物BRE121，它由核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物组成。

大白菜EST-SSR标记引物BRE131，它由核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物组成。

上述大白菜EST-SSR标记引物BRE28、大白菜EST-SSR标记引物BRE121和/或大白菜EST-SSR标记引物BRE131在大白菜品种鉴定中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)利用改良的CTAB法提取待鉴定样品总DNA；