[发明专利]一种从食用菌中提取的核苷酸混合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种从食用菌中提取的核苷酸混合物，其特征在于该核苷酸混合物是通过下列方法制备得到的：

a.提取核酸：食用菌或食用菌下脚料加水磨成匀浆，调节pH9-12，微波提取，过滤，调节pH7，得提取液；

b.浓缩纯化核酸：提取液经离心分离、中空纤维超滤膜富集分离、浓缩，浓缩液调节pH，在蛋白等电点静置过夜，离心，上清液调节pH，在核酸等电点静置过夜，离心，取沉淀物，洗涤，干燥，得核酸；

c.酶解：核酸加水溶解，加入5’-磷酸二酯酶进行酶解成5’-核苷酸；

d.收集核苷酸：利用阴离子交换树脂分离富集核苷酸，得到食用菌核苷酸混合物。

2.根据权利要求1所述的核苷酸混合物，其特征在于该核苷酸混合物是通过下列方法制备得到的：

(1)食用菌或食用菌下脚料制浆：食用菌或食用菌下脚料加水，料∶水重量比为1∶3～6，磨成匀浆状物，备用；

(2)核酸提取：

a.上述匀浆状物以1mol/L NaOH调节pH 11，加入NaCl使其浓度达4％，用微波提取，提取功率为300W，时间为30min.，提取1～2次，所得提取液300目过滤，离心15min，再用1mol/LHCl调节pH为7，得到提取液；

b.提取液经滤膜孔径为5000道尔顿的中空纤维超滤膜分离，控制压力为0.2mPa，温度为25℃，膜通量为60～140ml/min.，核酸被截留；

c.所得核酸截留液用6mol/L HCl调pH 4.2，4℃静置过夜，离心，得上清液；

d.所得上清液再用6mol/L HCl调pH 2.0，4℃静置过夜，离心，得到初步纯化的核酸沉淀物；

e.所得沉淀用50％乙醇冲洗，离心，60℃，0.09Mpa，真空干燥时2h，得到核酸干品；

(3)核酸酶解

称取上述制得的核酸干品，加蒸馏水，超声波辅助溶解，制成浓度为0.2wt％的核酸溶液，加入一定量5’-磷酸二酯酶酶液，酶解条件为：酶解时间3h、温度40℃、pH 5.8、酶底比为1300U/g；酶解结束，100℃灭酶10min，离心即得核苷酸混合物溶液；

(4)核苷酸富集分离

a.核酸经酶解成混合核苷酸后，调样液浓度为0.75mg/mL的核苷酸混合酶解液，用1mol/L NaOH调节核苷酸混合酶解液使其为最适pH10.0；

b.步骤a所得样液上阴离子交换树脂柱，控制上样速度1mL/min，上样液体积为树脂体积的8倍；

c.对上样后的阴离子交换树脂柱依次用3倍体积去离子水，1倍体积0.1mol/LHCl，1倍体积0.2mol/LHCl 1倍体积0.3mol/LHCl进行洗柱，然后用0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱，收集0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱液；

d.步骤c所得0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱液经透析袋透析，0.09mPa，60℃，真空浓缩干燥得核苷酸混合物制品。

3.根据权利要求1或2所述的核苷酸混合物，其特征在于食用菌为双孢蘑菇Agaricusbisporus、金针菇Flammulina velutipes、香菇Lentinus velutinus、杏鲍菇Pleurotuseryngii、平菇Pleurotus ostreatus中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的核苷酸混合物，其特征在于阴离子交换树脂为大孔强碱性阴离子交换树脂，优选型号为D201GF。

5.根据权利要求1或2所述的核苷酸混合物，其特征在于核苷酸混合物含有5’-胞苷酸、5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-尿苷酸。

6.权利要求1所述核苷酸混合物的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a.提取核酸：食用菌或食用菌下脚料加水磨成匀浆，调节pH9-12，微波提取，滤布过滤，调节pH7，得提取液；

b.浓缩纯化核酸：提取液经离心分离、中空纤维超滤膜富集分离、浓缩，浓缩液调节pH，在蛋白等电点静置过夜，离心，上清液调节pH，在核酸等电点静置过夜，离心，取沉淀物，洗涤，干燥，得核酸；

c.定向酶解：核酸加水溶解，加入5’-磷酸二酯酶定向酶解成5’-核苷酸；

d.收集核苷酸：利用阴离子交换树脂分离富集核苷酸，得到食用菌核苷酸混合物。