[发明专利]玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用

权利要求书

1.达托霉素基因工程菌的构建方法，其特征是利用PCR扩增NPRS上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ，将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是所述表达载体为整合型载体或高拷贝载体质粒载体。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE*；表述载体的出发载体为pIB139。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征是步骤如下：

(1)设计PCR引物扩增NRPS基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ；

(2)将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；

(3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；

(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子。

5.达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：

(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus基因工程菌HP-GJ01或HP-EF01的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；

(2)取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；

(3)以1％～4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中，在发酵培养中30℃培养，在0～30h，控制pH 6.5，溶氧45％；在30h～144h，控制pH 7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时；

(4)通过HPLC检测发酵液中的达托霉素浓度。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是所述的培养基组成及质量含量为：

种子液体培养基组成及质量含量为：糊精1g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05，CaCO₃ 0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH 7.0。

7.如权利要求5所述的应用，其特征是所述的发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄ 0.6g/L，初始pH 7.0。

8.达托霉素基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为玫瑰孢链霉菌(Streptomyces reseosporus)HP-EF01和HP-GJ01，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号分别为CGMCC No.3734和CGMCC No.3733。