[发明专利]玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种玫瑰孢链霉菌基因工程菌的构建方法及其在生产达托霉素中的应用。

背景技术

达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年和2006年达托霉素(Daptomycin，LY146032)先后被美国FDA和了欧洲药品评价署(EMEA)的认证和批准上市。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是菌种原始，达托霉素的产量低，生产成本很高，因此通过基因工程技术选育高产优良菌株，进一步提高达托霉素的产量，具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

本发明提供一种达托霉素的基因工程菌的构建方法，与出发菌株相比实例菌株的达托霉素产量的到了显著提高。

达托霉素在玫瑰孢链霉菌中由非核糖体蛋白合成酶(NRPS)指导合成。达托霉素合成基因簇一共有64个开放阅读框。其中位于NRPS基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ在达托霉素合成过程中起着关键作用。dptE、dptF分别编码乙酰辅酶A连接酶和酰基载体蛋白ACP，在生物功能上紧密相关，一同酰化游离的癸酸，酰化的癸酸与达托霉素直链尾部的色氨酸的缩合开启了达托霉素合成的第一步。dptG能够调控NRPS基因簇 或促进合成的抗生素排泄胞外，以减低对宿主的毒害。dptH编码硫脂酶，对达托霉素合成过程起到纠错的作用。dptI编码甲基化酶，以腺苷蛋氨酸为甲基供体催化α-酮戊二酸转化为三甲基化的α-酮戊二酸，然后在转氨酶的作用下催化其合成达托霉素重要前体3m-Glu。dptJ编码色氨酸双加氧酶，催化色氨酸的有氧降解，合成达托霉素重要前体Kyn。因此过表达NRPS基因上下游附属关键基因，可显著提高达托霉素的合成效率。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

达托霉素基因工程菌的构建方法，利用PCR扩增NPRS上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ，将基因片段连接到过表达载体，然后利用结合转移的方法转化玫瑰孢链霉菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因工程菌。

所述表达载体为整合型载体或高拷贝载体质粒载体。所述表达载体中NRPS附属基因的启动子为ermE*；表述载体的出发载体为pIB139。

达托霉素基因工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)设计PCR引物扩增NRPS基因上下游附属关键基因dptE、dptF、dptG、dptH、dptI、dptJ；

(2)将克隆得到的目的基因插入pIB139的组成型强启动子ermE*下游多克隆位点；

(3)然后将重组质粒导入大肠杆菌ET12567中，以备结合转移之用；

(4)将大肠杆菌ET12567与玫瑰孢链霉菌在MS培养基上37℃共培养20小时，然后用含有萘啶酮酸(25μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的无菌水将平板覆盖，再在30℃培养48小时，筛选转化子。

达托霉素基因工程菌的应用，其特征是：

(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus基因工程菌HP-GJ01或HP-EF01的斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；

(2)取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时，制备种子液；