[发明专利]HLA高分辨基因测序试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及用于人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen，HLA)-A，B，DRB1基因的扩增和分型方法，以及所述方法中使用的特异性引物。 

背景技术

HLA是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统，其在抗原识别、抗原递呈、免疫应答与调控、破坏外来抗原靶细胞等方面发挥重要的作用，是引起免疫排斥反应的主要物质基础。移植物细胞表面HLA-I类和HLA-II类抗原都是强移植抗原，体液免疫和细胞免疫都参与了对移植物的排斥反应，无论是异基因造血干细胞移植，还是器官移植，供受体之间HLA相配程度是决定移植成功的关键。 

目前国际标准的HLA分型技术有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT(聚合酶链式反应产物直接测序分型)。 

PCR-SSO(sequence specific oligonucleotide)：也称PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品要进行多次杂交(甚至十几次)才能完成定型分析操作也十分繁琐。于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法(reverse hybridization)。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物(待检测基因DNA)反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一(如温度，离子强度)，易出现误差；不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级；对某些杂合子分辨率也不好。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式不同，因此分辨率 不及SSP和SBT。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存(三种效果比较)。 

PCR-SSP：PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物(sequence specific primer，SSP)，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行，分辨率可从低到高，成本低。缺点是不易自动化；不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本(三种效果比较)。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂(引物)，且不能识别非经典的HLA基因和假基因(绿)。针对HLA外显子和内含子序列精心设计引物可避免这些问题。 

PCR-SBT：以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。因此，应用SBT技术进行HLA高分辨基因分型是目前国际上公认的HLA基因分型金标准。 

目前进口的HLA-SBT试剂只对HLA外显子(Exon 2，3)进行测序，当几个等位基因核苷酸区别在这些区域之外时，就无法进行区分，从而造成实验结果中有许多无法明确的组合(模棱两可的结果)。另外，SBT的试剂全部是从国外进口，试剂成本高。因此，需要进一步提高HLA测序的分辨率和精确性，同时降低测序试剂的成本。 

发明内容

本发明目的是提供一种人类白细胞抗原(Human Leucocyte Antigen，HLA)基因的分型方法，包括以下步骤： 

(1)按照常规技术提取待测基因组DNA，使用PCR扩增引物扩增所要分析的目的基因片段； 

(2)使用测序引物对步骤(1)所得PCR产物进行扩增，扩增各外显子，然后对扩增出的各外显子进行测序，并将测序结果与数据库中的标准序列进行比较，从而确定基因分型结果； 

其中，步骤(1)中所述目的基因片段包括HLA-A的2，3，4外显子，HLA-B的2，3，4外显子和HLA-DRB1位点2外显子； 

相应的PCR扩增引物对包括：HLA-A位点扩增引物，HLA-B位点扩增引物和HLA-DRB1位点扩增引物； 

其中，所述HLA-A位点扩增引物包括： 

正义引物，SEQ ID No.1：CCATTGGGTGTCGGGTTTC(-105～-87)；