[发明专利]一种肠球菌属多重PCR检测引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测引物及方法，具体涉及一种肠球菌属多重PCR检测引物及方法。

背景技术

肠球菌为革兰阳性球菌，主要存在于人类或动物的胃肠道，也广泛分布于土壤，水，食物中，是一种重要的条件致病菌。近年来，由于肠球菌耐药菌株的日益增多，肠球菌的医院感染率不断增加，引起尿路感染、菌血症、创口感染、感染性心内膜炎以及食物中毒等，已成为医院感染的重要病原。肠球菌可以感染多种动物，从猪、家蚕、羔羊、驴等动物体内均分离出致病性肠球菌，并且已有研究表明，肠球菌可以在人与动物之间进行水平传播，有报道称可由发病猪直接传染人，引起人发病死亡。

目前，鉴定肠球菌的标准方法主要是依靠生化试验进行表型鉴定，这需要大量的时间进行生化管的准备和判断结果。另外，一些商品化鉴定试剂盒API Rapid ID 32Srep、BBL Crystal和Vitek-32等，虽能够将肠球菌鉴定到种的水平，检测结果也能在24小时后得到有效判读，且不适用基层快速鉴定，目前PCR仪普及率逐步提高，与单重PCR相比多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性等优点，能在同一PCR反应管内同时检出多个型别的目的基因，适宜于成组病原体检测，节省时间，节省试剂，节约经费开支，能为临床提供更多更准确的诊断信息，建立一种快速鉴定种属的多重PCR方法显得尤为必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是传统的肠球菌属和主要肠球菌种的检测方法不适用基层快速鉴定，提供一种肠球菌多重PCR检测引物及方法。

本发明的技术方案是：一种肠球菌属多重PCR检测引物，它的序列如下：

肠球菌属引物的序列如下：

上游引物E1：5′-GTGTCGCTGATGGATGG-3′；

下游引物E2：5′-GCAAGCCGAACTGAGAGA-3′；

粪肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FL1：5′-ACATATGTGAATAACTTAACC-3′；

下游引物FL2：5′-TATTGGTGACTCTTGGTTTGG-3′；

屎肠球菌种引物的序列如下：

上游引物FM1：5′-GATAATACAATAGAAGAATTAT-3′；

下游引物FM2：5′-AGCTTTTTTGATATTCTTCTTTA-3′。

利用肠球菌属多重PCR检测引物检测肠球菌属的方法，包括提取样品的DNA后，用PCR反应体系和PCR反应程序对样品进行检测，

所述PCR反应体系，在25μl体系中加入以下成份：

2×PCRTaqMix              8μl

E1/FL1/FM1                3μl

E1/FL2/FM2                3μl

模板DNA                   2μl

dd H₂O                    9μl

                                    

总体积                    25μl

所述PCR反应程序为：

95℃预变性5min；进入循环，94℃变性30s，49℃退火1min，72℃延伸1min 10s，30个循环；72℃终止10min。

本发明的有益效果是：本发明建立了一种快速准确鉴定肠球菌的多重PCR方法，大大简化了查验程序，可以在很多基层实验室使用。能一次PCR鉴定到肠球菌属及粪肠球菌或屎肠球菌种，能最少检测出1ng的基因组DNA，敏感性高，特异性比较强，有利于肠球菌的鉴别与诊断，并且具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为临床中肠球菌的检测提供了一种新的快速检测方法，也为肠球菌感染的分子流行病学调查，研究肠球菌分子发病机制，早期诊断，诊断试剂盒的研制与开发，药物或疫苗的免疫机制提供了试验依据和技术手段。

本发明的检测结果，将190株疑似菌株，其中，70株分离自患病猪组织病料；60株分离自健康猪粪便；60株分离自零售鲜猪肉分别进行多重PCR，结果显示：粪肠球菌检出率分别为30％、46.7％、25％，屎肠球菌检出率分别为54.3％、38.3％、55％，其他肠球菌检出率分别为7.1％、10％、13.3％。

附图说明